三葉苷對N-甲基-D-天冬氨酸誘導的人神經母細胞瘤細胞損傷的保護作用

周芮萱，馬松濤，蔣剛

缺血性腦卒中（cerebral ischemic stoke）具有高發病率、高致殘率、高死亡率和高復發率等特點，是一種嚴重威脅人類健康的臨床常見疾病［1-2］。據世界衛生組織統計，全世界每年有150萬人發病，其中1/3的病人因此死亡，1/3的病人導致長期殘疾，嚴重影響病人生活質量［3］。因此，尋求有效的藥物預防和治療缺血性腦卒中刻不容緩。

N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體是谷氨酸鹽受體家族中的一員，是一種興奮性神經遞質谷氨酸的離子型受體。正常生理條件下，NMDA受體參與并維持多種神經系統功能。但在生理病變條件下，NMDA受體被過度激活，引起興奮性神經毒性，從而導致缺血性腦卒中疾病的發生。正因如此，NMDA受體成為了治療缺血性腦卒中的重要靶點。三葉苷是是多穗柯嫩葉的甜味主要成分，具有顯著降低血脂，減輕體質量，改善氧化應激狀態，清除自由基的作用［4］。目前有研究報道提示，三葉苷具有抗腦缺血作用，但其分子機制不夠明確［5］，因此，本研究于2015年11月至2016年7月通過建立體外興奮性毒性損傷模型，探究三葉苷的保護作用，并進行相關分子機制的研究。

1 材料與方法

1.1主要試劑三葉苷購自成都Biopurify公司（批號PRF15092821）；NMDA和乙二胺四乙酸（EDTA）購自美國Amresco公司；DMEM細胞培養基、高糖培養液和胎牛血清購自美國Hyclone公司；胰酶和四甲基偶氮唑藍（MTT）購自美國Sigma公司；N-（2-羥乙基）哌嗪-N-乙磺酸鈉（HEPES）購自江蘇碧云天生物技術研究所；乳酸脫氫酶（LDH）定量檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；凋亡蛋白Bcl-2，Bax抗體，美國Santa Cruz公司；NR2B亞基蛋白抗體，美國CST公司；鼠β-肌動蛋白（β-actin）抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology；辣根過氧化酶標記的羊抗兔，羊抗鼠二抗購自上海中杉金橋；RIPA蛋白裂解液由江蘇碧云天生物技術研究所提供。

1.2主要儀器日本SANYO HF90二氧化碳培養箱；日本Olympus IX53光學倒置顯微鏡；美國BIOTEK ELx800酶標測試儀。

1.3細胞株人神經母細胞瘤細胞（SH-SY5Y）株由沈陽藥科大學惠贈。

1.4實驗方法

1.4.1細胞培養 SH-SY5Y細胞系培養于DMEM完全培養液，含有10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素雙抗。于5%二氧化碳，37°C的培養箱中培養。

1.4.2四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT法）檢測三葉苷對SH-SY5Y細胞存活率的影響 取對數生長期細胞并計數，以1.0×105/mL的密度接種于96孔板內，每孔100 μL，于5%二氧化碳，37 °C的培養箱中培養24 h后，加入終濃度為25，50，100和200 μmol/L的三葉苷100 μL培養24 h，然后向每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL（終濃度約0.5 mg/mL），置于細胞培養箱中孵育4 h，孵育結束后，棄去上清液，向每孔中加入150 μL的二甲基亞砜（DMSO），震搖5 min，于酶標儀490 nm處測定其吸光度，計算細胞存活率。

1.4.3NMDA誘導SH-SY5Y細胞損傷模型的建立

采用NMDA（0 μmol/L，1 μmol/L，2 μmol/L，5 μmol/L）共孵30 min，更換培養液繼續培養12 h，顯微鏡下觀察細胞形態變化，采用MTT法檢測細胞損傷模型的建立。

1.4.4MTT法檢測三葉苷對NMDA誘導損傷的SHSY5Y細胞的保護作用 取細胞損傷模型對數生長期細胞并計數，以1.0×105/mL的密度接種于96孔板內，每孔100 μL，于5%二氧化碳，37°C 的培養箱中培養24 h后，分別加入終濃度為0，10，50，100 μmol/L的三葉苷孵育4 h，按1.4.3建立三葉苷干預細胞損傷模型，計算細胞存活率。

1.4.5三葉苷對NMDA誘導損傷的SH-SY5Y細胞LDH釋放量的影響 細胞分組及培養同1.4.4，按照LDH試劑盒操作要求進行反應，反應結束后用酶標儀測定在490 nm的吸光度，計算細胞凋亡率。

1.4.6三葉苷對NMDA誘導損傷的SH-SY5Y細胞蛋白表達的影響 蛋白質印跡法（Western Blot）檢測促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2及NMDA受體調節亞單位NR2B蛋白表達，采用BCA蛋白定量法檢測蛋白濃度。每組按20 μL蛋白上樣進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）后，用5%脫脂奶粉封閉1 h，將一抗的抗體按照說明書用封閉液配制至適當的濃度，4℃孵育過夜。各個抗體稀釋的倍數如下：Bcl-2（1∶600），Bax（1∶600），β-actin（1∶1000），NR2B（1∶1000）。次日用等滲緩沖鹽溶液（TBST）漂洗膜3次，每次5 min。將二抗按1∶8 000比例用TBST稀釋，室溫下孵育1 h。用TBST漂洗膜3次，每次10 min，最后以增強化學發光法（ECL）顯影，β-actin作為內參，采用Image J灰度分析軟件，對所得蛋白條帶進行定量分析。

1.5統計學方法實驗數據以±s表示，利用SPSS 16.0軟件統計處理，兩組間比較應用成組t檢驗，多組間比較應用單因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1三葉苷對SH-SY5Y細胞生長的影響通過MTT法檢測三葉苷對SH-SY5Y細胞活性的影響，結果顯示，三葉苷組在0～100 μmol/L范圍內對SHSY5Y細胞的生長無明顯影響，在200 μmol/L濃度時，細胞存活率為（86.46±2.01）%，開始對細胞生長產生抑制作用，與對照組（0 μmol/L三葉苷）相比，差異有統計學意義（P＜0.01）。因此本研究選擇10，50，100 μmol/L作為后續活性測試濃度。

2.2NMDA誘導SH-SY5Y細胞損傷模型的建立采用MTT法檢測NMDA對SH-SY5Y細胞存活率的影響，結果顯示，1，2，5 mmol/L NMDA誘導下的細胞存活率分別為（82.99±3.13）%，（53.13±3.31）%，（26.34±1.97）%，差異有統計學意義（F=262.1，P＜0.001）。隨著NMDA濃度的增加，對細胞的抑制作用也逐步開始增加。2 mmol/L的NMDA造模30 min，對細胞抑制率達到50.00%左右，因此選用2 mmol/L的NMDA為造模濃度。

2.3MTT法檢測三葉苷對NMDA誘導損傷的SHSY5Y細胞存活率的影響采用MTT法初步檢測確定三葉苷對NMDA誘導損傷的SH-SY5Y細胞具有保護作用。實驗結果表明，NMDA（2 mmol/L，30 min）誘導損傷的模型中，NMDA損傷模型（0 μmol/L三葉苷）組細胞存活率為（53.51±2.07）%；在三葉苷濃度為10，50，100 μmol/L的條件下，細胞存活率分別 為（56.28±2.05）% 、（68.64±1.74）% 、（75.98±1.84）%，差異有統計學意義（F=293.3，P＜0.001），說明三葉苷對NMDA誘導損傷的SH-SY5Y細胞的保護作用具有濃度依賴性。

2.4三葉苷對NMDA誘導損傷的SH-SY5Y細胞LDH釋放量的影響LDH釋放量法可間接反映細胞凋亡狀態，采用LDH法再次證明了三葉苷對NMDA誘導損傷的SH-SY5Y細胞具有保護作用。實驗結果顯示，NMDA增加了細胞凋亡，NMDA損傷模型（0 μmol/L三葉苷）組細胞凋亡率達到了（52.50±1.97）%，與對照組（0 mmol/L NMDA）細胞凋亡率（10.29±2.11）%比較差異有統計學意義（t=58.93，P＜0.001）；不同濃度的三葉苷（10，50，100 μmol/L）能減少細胞凋亡，細胞凋亡率分別為（39.80±1.76）%、（31.13±2.21）%、（22.18±2.52）%，差異有統計學意義（F=314.1，P＜0.001），表明三葉苷對NMDA誘導損傷細胞的保護作用呈現濃度依賴性。

2.5三葉苷對NMDA誘導損傷的SH-SY5Y細胞蛋白表達的影響Bax和Bcl-2是細胞內與凋亡關系密切的蛋白，細胞發生凋亡時，凋亡蛋白Bax表達量上升，抗凋亡蛋白Bcl-2表達量下降。從圖1可知，與對照組（0 mmol/L NMDA）細胞蛋白Bax表達量（0.044±0.003）、蛋白Bcl-2表達量（1.290±0.051）、NR2B蛋白表達（0.068±0.003）相比，NMDA損傷模型（0 μmol/L三葉苷）組細胞蛋白Bax表達量（0.270±0.016）明顯升高（t=24.64，P＜0.001），蛋白Bcl-2表達量（0.790±0.028）下降（t=15.65，P＜0.001），NR2B蛋白表達（0.340±0.019）明顯增加（t=24.89，P＜0.001）。與NMDA損傷模型（0 μmol/L三葉苷）組相比，三葉苷（10，50，100 μmol/L）組細胞蛋白Bax表達量（0.300±0.020）、（0.200±0.015）、（0.110±0.002）隨藥物濃度的增加逐漸減少（均P＜0.01），蛋白Bcl-2表達量（1.100±0.028）、（1.240±0.062）、（1.400±0.047）明顯升高（均P＜0.001），NR2B蛋白表達（0.190±0.013）、（0.160±0.160）、（0.120±0.006）隨藥物濃度的增加逐漸減少（均P＜0.001）。

圖1 三葉苷對NMDA誘導損傷的SH-SY5Y細胞蛋白（NR2B、Bax和Bcl-2）表達的影響（蛋白質印跡法）

3 討論

據流行病學統計，我國年齡標化的卒中患病率為1 115/10萬，每年的年齡標化發病率為247/10萬，死亡率為115/10萬［6］。目前，腦卒中已經成為我國第1位的致死原因。缺血性腦卒中的發病機制復雜，由神經興奮性毒性、鈣離子超載、再灌注損傷、酶系統激活、細胞凋亡等共同參與，最終引起細胞死亡［7］。發病過程是由于腦供血不足使腦細胞失去能量及氧氣的供應，從而導致興奮性氨基酸（EAA）谷氨酸大量釋放，使NMDA受體被過度激活，引起細胞內鈣離子超載，最終導致細胞死亡［8］。由此可見，NMDA受體介導的興奮性毒性和鈣離子超載是缺血性腦卒中發病機制的觸發者。而腦缺血發生后，在致死區和正常區之間存在半暗帶，這個區域可保持一定量的血流以維持新陳代謝［9］。缺血中心區和缺血半暗帶的細胞損傷和死亡方式具有明顯的差異，在缺血中心區，細胞是以急性壞死為主要方式，具有不可逆性；而半暗帶細胞的凋亡需要鈣離子、細胞信號傳導機制、基因轉錄等參與，具有潛在可挽救性［10］。目前，研究發現，選擇性NMDA受體拮抗劑可起到神經保護的作用，挽救缺血半暗帶部分殘留的尚具活力的可逆性損傷神經元和腦組織，且具有臨床應用的可能［11］。NMDA受體為興奮性氨基酸谷氨酸的離子型受體，具有異四聚體結構，由NR1，NR2，NR3及NR4等亞單位組成，NR1是基本的功能亞單位，NR2是重要的調節亞單位，有NR2A，NR2B，NR2C，NR2D等4個不同的亞型［12-14］。近期研究表示，不同類型的NR2亞單位構成的NMDA受體對神經損傷表現出不同的作用，含有NR2B的NMDAR及其介導的信號分子在興奮毒性和缺血引起的神經元死亡中起主要作用15］。當NMDA-NR2B亞基被激活時，大量鈣離子內流，從而激活一系列的酶系統，最終引起細胞死亡。研究結果顯示，隨著三葉苷藥物濃度的增加，NMDA-NR2B蛋白的表達逐漸減少，說明三葉苷對NMDA誘導的SH-SY5Y細胞損傷的保護作用機制與NMDA-NR2B亞單位相關。

NMDA受體介導的興奮性毒性和鈣離子超載是缺血性腦卒中發病機制的觸發者，本研究結果表明，三葉苷對NMDA誘導的SH-SY5Y細胞損傷有保護作用。NMDA刺激SH-SY5Y細胞可導致細胞發生凋亡，NMDA受體介導的興奮性神經毒性將導致神經元的凋亡［16-17］。實驗結果顯示，三葉苷能減少細胞凋亡的發生，可以降低NMDA誘導的LDH釋放量的增加。三葉苷通過上調Bcl-2，抑制Bax表達達到神經保護作用，以上研究結果表明三葉苷可以抑制NMDA誘導的神經興奮性毒性的發生，可挽救缺血半暗帶部分殘留的尚具活力的可逆性損傷神經元和腦組織，為三葉苷在缺血性腦卒中的防治方面提供了實驗依據。本研究僅僅表明三葉苷的作用機制與NMDA-NR2B亞單位相關，但具體的作用機制有待進一步的研究。