姜黃素對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎破骨細(xì)胞分化中核因子κB受體活化因子基因及蛋白表達(dá)的影響

徐子涵，蔡佳宇，李婧，商瑋，趙智明，蔡輝

骨破壞是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）主要的病理特征之一，往往導(dǎo)致進(jìn)行性關(guān)節(jié)損傷和關(guān)節(jié)功能減退［1］。破骨細(xì)胞（osteoclast，OC）的活化是導(dǎo)致RA早期骨丟失的主要機(jī)制［2］，RA病人全身骨丟失的加重與OC活性增加密不可分［3］。核因子κB受體活化因子（receptor activator for nuclear factor-κB，RANK）是破骨細(xì)胞前體細(xì)胞（osteoclast precursor cell，OPC）或成熟OC表面的關(guān)鍵跨膜分子，被其配體（RANK ligand，RANKL）激活，導(dǎo)致OC分化過程中特異性基因的表達(dá)以及成熟OC骨吸收功能的活化［4-6］。姜黃素（Curcumin）是中藥姜黃的主要藥效成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗血管生成等多方面藥理作用［7］。Chandran等［8］對活動性RA病人進(jìn)行的臨床研究已證實(shí)了姜黃素用藥的安全性和有效性。本課題組前期在動物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，姜黃素提高佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠骨密度水平是通過調(diào)節(jié)RANKL/OPG（骨保護(hù)素）比值實(shí)現(xiàn)的［9］。本研究通過建立RA病人OC體外培養(yǎng)體系，探究姜黃素對RA病人OC分化中RANK基因和蛋白表達(dá)的影響及其可能機(jī)制，為姜黃素應(yīng)用于RA骨破壞的防治提供依據(jù)。

圖1 姜黃素對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人破骨細(xì)胞分化的影響（TRAP染色×200）：A為空白對照組；B、C、D分別為姜黃素2.5 μmol/L組、5 μmol/L組、10 μmol/L組

1 資料與方法

1.1一般資料病例為2015年1—12月在東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院門診或住院治療的RA病人12例，年齡（42.3±14.4）歲，符合2010年RA分類標(biāo)準(zhǔn)［10］，均處于疾病活動期。排除肝腎功能不全者，患有內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病及腫瘤性疾病者，長期服用抗凝劑、性激素類藥物及調(diào)節(jié)骨代謝藥物者。受試者均簽署知情同意書，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2材料胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司，RANKL、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）購于美國Pepro Tech公司，人淋巴細(xì)胞分離液購于美國Sigma公司，α-MEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司，抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒購于南京建成科技有限公司，實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time PCR）（Master Mix SYBR Green）試劑盒購于日本TOYOBO公司，RANK抗體購于Cell Signaling Technology公司。

1.3方法（1）建立外周血OC培養(yǎng)體系。采集RA病人外周血10 mL，密度梯度離心法分離外周血單個 核 細(xì) 胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），接種于培養(yǎng)皿中（2×106/cm2），培養(yǎng)箱（37℃，5%二氧化碳）內(nèi)孵育2～3 h獲得貼壁細(xì)胞，接種于24孔板中（2×105/cm2），用α-MEM培養(yǎng)基配置細(xì)胞培養(yǎng)液（100 ng/mL RANKL、50 ng/mL M-CSF及20%胎牛血清），2～3 d換液1次［11］。

（2）姜黃素細(xì)胞毒性檢測。于96孔板中加入5×105/mL的單核細(xì)胞懸液（每孔100 μL），放置于培養(yǎng)箱中24 h，向培養(yǎng)板中加入含藥培養(yǎng)基（0、2.5、5、10 μmol/L），每組3個復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中孵育24 h、48 h和72 h后，加入CCK-8溶液10 μL，孵育4 h，設(shè)空白孔（只含有培養(yǎng)基和CCK-8溶液），對照孔（含有細(xì)胞、培養(yǎng)基和CCK-8溶液）。用酶標(biāo)儀于450 nm波長處測吸光度OD值，進(jìn)行細(xì)胞存活率計算。參照下列公式：細(xì)胞存活率（%）=［（含藥組OD值-空白孔OD值）/（對照孔OD值-空白孔OD值）］×100%。

（3）分組與給藥。設(shè)4組：空白對照組（含100 ng/mL RANKL、50 ng/mL M-CSF的α-MEM培養(yǎng)基）；姜黃素2.5 μmol/L組、姜黃素5 μmol/L組和姜黃素10 μmol/L組為在空白對照組的培養(yǎng)條件下再分別加入2.5、5和10 μmol/L姜黃素溶液。每組設(shè)3個復(fù)孔。

（4）TRAP染色并計數(shù)。2～3 d換液并于光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，直至見多核巨細(xì)胞形成后進(jìn)行TRAP染色。參照說明書配制底物反應(yīng)液，置于37℃水浴箱中10 min；隨后將細(xì)胞固定，加入底物反應(yīng)液置于培養(yǎng)箱中1 h，隨后用蘇木精復(fù)染2～3 min。染色陽性的體征為細(xì)胞胞質(zhì)呈深紅色、胞核呈藍(lán)紫色。將TRAP染色陽性的多核巨細(xì)胞（細(xì)胞核≥3個）認(rèn)定為OC。采用雙盲法計數(shù)陽性細(xì)胞，每孔隨機(jī)取10個視野（×200）計數(shù)OC個數(shù)，重復(fù)計數(shù)3次，取均值。

（5）Real-time PCR檢測各組細(xì)胞RANK基因的表達(dá)。細(xì)胞培養(yǎng)至14 d，用TRIZOL試劑提取細(xì)胞總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，對cDNA樣本進(jìn)行Real-time PCR分析，檢測RANK基因mRNA的表達(dá)。反應(yīng)體系10 μL，cDNA模板（稀釋10倍）1 μL，正、反向引物各1 μL，0.1%DEPC水7 μL。Primer 5軟件設(shè)計引物（見表1），所有引物由南京金斯瑞科技有限公司合成，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參基因，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，目的基因的相對表達(dá)值用2-ΔΔCT公式［12］進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

表1 PCR引物序列

（6）蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測各組細(xì)胞RANK蛋白的表達(dá)。用RIPA提取細(xì)胞總蛋白，并進(jìn)行蛋白定量（BCA法），煮沸變性5 min，上樣后經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），5%脫脂奶粉封閉2 h，加入RANK一抗4℃孵育過夜，加入二抗，室溫孵育2 h，曝光顯影，計算各條帶的灰度值，以β-肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參蛋白，結(jié)果以RANK與β-actin吸光度比值來表示。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。觀測資料主要為計量資料，以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析+多重比較LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1姜黃素對細(xì)胞存活率的影響CCK-8檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h姜黃素2.5 μmol/L組、姜黃素5 μmol/L組和姜黃素10 μmol/L組細(xì)胞存活率（%）分別為（99.28±4.03）、（98.91±2.80）、（99.54±4.50），與空白對照組（100.00±5.31）相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；培養(yǎng)48 h姜黃素各濃度組細(xì)胞存活率（%）分別為（97.90±1.71）、（96.57±4.01）、（95.50±4.33），與空白對照組（100.00±8.85）相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；培養(yǎng)72 h姜黃素各濃度組細(xì)胞存活率（%）分別為（93.94±8.10）、（97.61±8.23）、（92.49±8.65），與空白對照組（100.00±2.28）相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2姜黃素對RA病人OC分化的影響于200×光鏡下觀察，空白對照組細(xì)胞形態(tài)均一、分布均勻、輪廓清晰，有3～5個以上細(xì)胞核，符合OC的基本特征，見圖1A。經(jīng)不同濃度姜黃素干預(yù)后，視野內(nèi)多核細(xì)胞數(shù)量明顯減少，形態(tài)欠規(guī)則，大部分為未分化成熟的細(xì)胞，見圖1B、1C、1D。

姜黃素2.5 μmol/L組、姜黃素5 μmol/L組和姜黃素10 μmol/L組TRAP陽性細(xì)胞數(shù)（個/10個視野）分別為（103.00±4.36）、（91.00±7.81）和（67.33±4.16），與空白對照組（166.00±11.53）相比均明顯減少（P＜0.05），說明姜黃素對RA病人OC分化具有抑制作用。見圖2。

圖2 姜黃素對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人破骨細(xì)胞分化的影響

2.3姜黃素對各組細(xì)胞RANK基因表達(dá)的影響采用Real-time PCR法對各組細(xì)胞中RANK mRNA水平進(jìn)行檢測。姜黃素2.5 μmol/L組、姜黃素5 μmol/L組和姜黃素10 μmol/L組細(xì)胞中RANK mRNA的相對表達(dá)量分別為（1.03±0.12）、（0.48±0.10）和（0.26±0.04），與空白對照組（1.44±0.16）相比均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明姜黃素能抑制RA病人OC中RANK mRNA的表達(dá)水平。見圖3。

圖3 姜黃素對各組細(xì)胞核因子κB受體活化因子（RANK）基因表達(dá)的影響

2.4姜黃素對各組細(xì)胞RANK蛋白表達(dá)的影響蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，與空白對照組相比，姜黃素2.5 μmol/L 組、姜黃素 5 μmol/L組和姜黃素 10 μmol/L組細(xì)胞中RANK蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。可見姜黃素具有抑制RA病人OC中RANK蛋白表達(dá)水平的作用。見表2，圖4。

表2 各組細(xì)胞RANK蛋白表達(dá)水平/±s

表2 各組細(xì)胞RANK蛋白表達(dá)水平/±s

注：與空白對照組比較，aP＜0.05

組別空白對照組姜黃素2.5 μmol/L組姜黃素5 μmol/L組姜黃素10 μmol/L組F值P值次數(shù)5 5 5 5 RANK/β-actin 0.68±0.11 0.46±0.09a 0.36±0.08a 0.25±0.07a 21.278 0.000

圖4 姜黃素給藥與否的各組細(xì)胞核因子κB受體活化因子（RANK）蛋白電泳圖

3 討論

姜黃素是從中藥姜黃中獲得的四萜類化合物。《本草綱目》記載姜黃“治風(fēng)痹臂痛”，《醫(yī)林纂要》記載姜黃“治四肢風(fēng)寒濕痹”。RA是慢性炎癥性疾病，可造成關(guān)節(jié)損傷和骨質(zhì)破壞，屬中醫(yī)“痹證”范疇。歷代諸多醫(yī)家將姜黃用于風(fēng)寒濕痹，其中的代表方劑是五痹湯，以姜黃為君藥，與羌活、白術(shù)、防己、甘草同用，通痹止痛。現(xiàn)代藥理研究顯示，姜黃素具有抗炎、抗氧化和抗癌活性［7］。本課題組前期研究表明，姜黃素能調(diào)節(jié)RANKL/OPG比值，提高佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠骨密度水平［9］。本研究進(jìn)一步探索姜黃素在治療RA骨破壞中的作用及其可能機(jī)制。

OC是主要的骨吸收細(xì)胞，來源于骨髓造血干細(xì)胞分化而來的單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，進(jìn)入外周血后循環(huán)在單核細(xì)胞層。在多種因素的作用下，這些細(xì)胞特定向骨吸收區(qū)移動，黏附于骨表面由OPC融合成OC發(fā)揮骨吸收功能。OC的異常增生與活化在RA骨破壞中發(fā)揮重要作用［2］。OC是終末分化細(xì)胞，不能傳代且存活時間短，難以分離獲得［13］。外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)法由Fujikawa等［14］首次提出并實(shí)驗(yàn)成功，是常用的OC培養(yǎng)方法之一，適用于人體OC研究，可獲得大量OC。本研究采用密度梯度離心法分離獲得RA病人PBMC，貼壁培養(yǎng)后獲得單核細(xì)胞，經(jīng)RANKL和M-CSF誘導(dǎo)分化為OC。CCK-8檢測姜黃素的細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)姜黃素2.5、5和10 μmol/L的濃度對細(xì)胞存活率無明顯影響，故設(shè)定為本實(shí)驗(yàn)姜黃素干預(yù)濃度。TRAP是OC分化和骨吸收功能的特異性酶，是OC分化的標(biāo)志物，與骨吸收功能密切相關(guān)。獲得的細(xì)胞進(jìn)行TRAP染色，通過TRAP染色陽性細(xì)胞計數(shù)來評估OC分化情況。結(jié)果顯示，經(jīng)2.5、5和10 μmol/L 姜黃素干預(yù)后，OC的數(shù)量較對照組明顯減少，提示姜黃素能有效地抑制RA病人OC分化。

在OPC向OC分化的過程中，RANKL-RANKOPG系統(tǒng)發(fā)揮關(guān)鍵作用［15-16］。RANK是位于OPC及OC表面的I型跨膜受體蛋白，是RANKL信號的唯一靶向受體，在細(xì)胞表面與RANKL結(jié)合調(diào)節(jié)OC的分化與功能，促使OC相關(guān)基因如TRAP、組織蛋白酶K、基質(zhì)金屬蛋白酶-9等的表達(dá)［17-18］。本研究分別從基因和蛋白層面表明姜黃素抑制RA病人OC分化過程中關(guān)鍵信號分子RANK mRNA和蛋白的表達(dá)，說明姜黃素可能是通過降低OPC表面RANK的表達(dá)，使其與RANKL結(jié)合減少，從而減弱RANKL信號傳導(dǎo)及下游轉(zhuǎn)錄因子的活化，抑制OC的分化成熟及功能。

綜上所述，姜黃素對RA病人OC分化和成熟具有抑制作用，其機(jī)制可能與下調(diào)RANK基因和相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。本研究初步探索了姜黃素抑制RA病人OC分化的可能機(jī)制，為開發(fā)姜黃素相關(guān)藥物應(yīng)用于RA骨破壞的治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。（本文圖1見插圖10-1）