精氨酸加壓素聯(lián)合丹參素對骨質疏松患者成骨細胞凋亡及增殖的影響

曹子君，王亞蘭，陳妮妮，郝定均，李青梅，胡靖，張正平，董亮

(1.西北工業(yè)大學保健室，陜西 西安 710072；2.西安交通大學附屬紅會醫(yī)院，陜西 西安 710054)

骨質疏松是一類以骨密度降低為典型癥狀的疾病，臨床主要為腰背疼痛、椎體變形、骨骼疼痛等，發(fā)病的主要機理為骨質減少，使骨的微結構遭到破壞，進而引發(fā)骨質脆性增加、彈性下降。臨床研究[1-3]認為，該病的發(fā)生與飲食結構、生活方式、激素水平等密切相關，且隨著患者年齡的增長，發(fā)病率會大幅提升。骨質疏松不僅會引發(fā)患者疼痛、體型改變，還會大大增加骨折發(fā)生的幾率，嚴重影響患者的日常生活。精氨酸加壓素也稱為血管加壓素、抗利尿激素，是由下丘腦產(chǎn)生并儲存于神經(jīng)垂體的一類激素，在調節(jié)顱內壓和腦組織代謝中發(fā)揮重要生理作用。丹參素是丹參水溶成分中的主要藥效成分之一，具有抗氧化、提高機體免疫力等作用[4-5]。本研究擬通過精氨酸加壓素聯(lián)合丹參素對骨質疏松患者成骨細胞凋亡和增殖的影響觀察，為臨床干預治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇1例來自西北工業(yè)大學保健室接受髖關節(jié)手術治療的骨質疏松患者的骨組織為研究材料。患者為男性，59歲，因摔傷導致骨折，無其他合并癥。患者簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理學會批準。

1.2 方法

1.2.1 成骨細胞培養(yǎng) 將取出的骨塊使用生理鹽水沖洗，而后轉入無菌試管中置入細胞培養(yǎng)室中，使用骨塊培養(yǎng)成骨細胞，具體步驟如下：(1)使用含有100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素的平衡鹽溶液沖洗骨組織；(2)將骨組織置入一無菌培養(yǎng)皿中，切骨小梁置入另一無菌培養(yǎng)皿；(3)加入D-hanks溶液浸泡骨小梁，去除骨組織上殘留的脂肪及血液；(4)使用完全培養(yǎng)液調制細胞培養(yǎng)液；(5)將骨小梁切為碎塊后置入細胞培養(yǎng)液中，使用骨組織接種環(huán)將骨小梁鋪散于瓶底，37 ℃條件下培養(yǎng)，觀察細胞生長滿瓶底后，去除骨組織塊，使用胰蛋白酶消化離心法提取成骨細胞。

1.2.2 分組干預 將成骨細胞使用胰蛋白酶適當消化后，將細胞吹打為單細胞懸液并計數(shù)，以1×104/L的濃度將細胞接種于培養(yǎng)板中，均分為A、B、C、D四組。A組細胞使用生理鹽水實施干預，B組細胞加入100 nmol/L的精氨酸加壓素實施干預，C組細胞加入20 μg/mL丹參素實施干預，D組細胞加入100 nmol/L的精氨酸加壓素+20 μg/mL丹參素實施干預，4組細胞均干預3 d。

1.2.3 觀察指標 (1)細胞凋亡的評估：在培養(yǎng)孔中加入20 μL質量濃度為5.0 g/L的MTT溶液，于37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，而后吸去培養(yǎng)液中的上層清液，在培養(yǎng)孔中加入150 μL的DMSO，放置于水平振蕩器上震蕩10 min后使用甲臜充分溶解，而后于酶聯(lián)免疫檢測儀上設置490 nm波長條件下檢測培養(yǎng)孔吸光度，進而推測細胞凋亡情況。(2)凋亡蛋白表達檢測：檢測4組細胞干預3 d后凋亡蛋白Bax、AIF、cyto-C蛋白的表達情況，并進行對比分析。(3)成骨細胞增殖計算：取生長良好的成骨細胞使用胰酶消化后，使用體積分數(shù)為1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)基和體積分數(shù)為12%的胎牛血清重懸細胞，并接種于6孔板中，24 h后，按分組條件實施干預，3 d后收集細胞，并取上層清液檢測堿性磷酸酶，于450 nm波長處檢測吸光度，計算細胞增殖情況。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 各組細胞凋亡情況比較

干預3 d后，4組成骨細胞凋亡情況為D組最小，B和C組相近，A組最大。除B組和C組相比差異無統(tǒng)計學意義外(P>0.05)，其余各組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組細胞凋亡情況比較

*P<0.05，與B組、C組、D組相比，#P<0.05，與D組相比。

2.2 各組凋亡蛋白表達情況比較

細胞凋亡相關蛋白Bax、AIF、cyto-C蛋白表達情況為D組最小，B和C組次之，A組最大。其中，D組明顯低于B組和C組(P<0.05)，B組和C組明顯低于A組(P<0.05)，B組和C組組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組凋亡蛋白表達情況比較(x±s)

*P<0.05，與B組和C組相比；#P<0.05，與A組相比。

2.3 各組成骨細胞增殖及BMP-2增殖蛋白表達情況比較

4組細胞增殖情況及BMP-2增殖蛋白表達為D組最大，B和C組次之，A組最小。其中，D組高于B和C組(P<0.05)，B和C組高于A組(P<0.05)，B和C組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組成骨細胞增殖情況比較

*P<0.05，與B組和C組相比；#P<0.05，與A組相比。

3 討論

骨質疏松是以骨骼重量減輕、骨骼微結構發(fā)生損壞致骨彈性降低的一類骨骼疾病，容易發(fā)生疼痛、骨折等臨床現(xiàn)象。統(tǒng)計數(shù)據(jù)[6]顯示，現(xiàn)階段我國約有9千萬骨質疏松患者，且該數(shù)字隨著社會老齡化趨勢的上升而逐年提升。骨質疏松不但會降低患者的骨密度，誘發(fā)疼痛、體態(tài)變化等現(xiàn)象，也會影響患者的生活質量，降低患者的自主生活能力。因此，如何通過治療提高骨質疏松患者的骨密度是現(xiàn)階段醫(yī)務工作者研究的重點。現(xiàn)有臨床研究[7]顯示，骨質疏松的發(fā)病機理主要與患者的激素水平、營養(yǎng)狀況、遺傳因素等有關。王亞春等[8]的研究指出，相比于絕經(jīng)前健康婦女，絕經(jīng)后的骨質疏松婦女其雌激素水平會出現(xiàn)顯著下降，同時骨標志物β-膠原降解產(chǎn)物水平也會出現(xiàn)顯著變化，提示激素在骨質疏松的發(fā)病中發(fā)揮了重要作用。華關民等[9]的研究也指出，不同性別不同年齡個體骨質疏松及血清骨標志物水平存在明顯的差異。

成骨細胞是由內外骨膜和骨髓中基質內的間充質始祖細胞分化而來的，能夠分泌多種生物活性物質，對骨形成和重建過程產(chǎn)生較大影響的一類細胞，是骨形成的主要功能細胞，在骨基質的合成、分泌和礦化過程中可發(fā)揮較大作用，其與破骨細胞的平衡是維持機體正常骨量的關鍵，一旦平衡被打破，則易出現(xiàn)骨質疏松等病理性改變。楊越華[10]的研究指出，氧化應激反應與骨質疏松形成具有密切聯(lián)系，成骨細胞在過氧化狀態(tài)下凋亡會明顯增加，破壞成骨細胞與破骨細胞之間的平衡狀態(tài)，進而誘發(fā)骨質疏松出現(xiàn)。另有研究指出，通過對去勢大鼠破骨細胞及成骨細胞平衡的調節(jié)，能夠顯著緩解大鼠骨質疏松癥狀，提高其骨密度。以上研究均提示，對成骨細胞凋亡及增殖的干預就治療骨質疏松具有重要意義。

本研究通過體外培養(yǎng)骨質疏松患者成骨細胞并分組實施干預的方式，就精氨酸加壓素聯(lián)合丹參素對骨質疏松患者成骨細胞凋亡及增殖的影響進行了探究，結果顯示，相比于使用生理鹽水進行干預的A組細胞，使用精氨酸加壓素干預的B組及使用丹參素進行干預的C組細胞治療后其凋亡情況明顯較小，同時B、C兩組細胞凋亡相關蛋白Bax、AIF、cyto-C表達情況也較A組明顯降低。結合相關文獻分析，骨質疏松的出現(xiàn)與個體激素水平有緊密的聯(lián)系，而合成精氨酸加壓素的垂體在激素分泌、保存中具有重要作用，垂體功能減退會導致個體骨量丟失，進而誘發(fā)骨質疏松。吳慶田等[11]通過將小鼠成骨細胞進行分組干預發(fā)現(xiàn)，加用精氨酸加壓素的小鼠成骨細胞其細胞內cAMP水平會明顯上升，而cAMP能夠通過活化蛋白激酶A進而引發(fā)一系列生物學反應，如細胞增殖分化等，對成骨細胞的凋亡及增殖產(chǎn)生影響。丹參素具有顯著的抗氧化作用，臨床應用證實在治療骨質疏松中具有較好的效果。王秉義等[12]通過將60只大鼠進行分組干預的方式發(fā)現(xiàn)，丹參素具有拮抗醋酸潑尼松龍誘導氧化應激所致骨質疏松大鼠中成骨細胞凋亡的作用，其機理為通過活化PI3k/Akt通路從而減少成骨細胞的凋亡。此外，丹參素中含有多個酚經(jīng)基，能夠提供活性氧進而阻止脂質過氧化反應，降低過氧化對成骨細胞造成的損傷。本研究結果還顯示，精氨酸加壓素聯(lián)合丹參素能夠更有效的抑制骨質疏松患者成骨細胞的凋亡，加快成骨細胞的增殖，分析其原因可能為兩種藥物合用能夠從不同方面對成骨細胞產(chǎn)生影響，進而加快了成骨細胞的增殖。

綜上所述，精氨酸加壓素聯(lián)合丹參素能夠有效抑制骨質疏松患者成骨細胞凋亡，同時還可促進成骨細胞增殖，且效果優(yōu)于單獨干預，是臨床值得推廣的一種干預治療方案。