結直腸癌組織中P4HB的表達及意義

周穎，陸麗華，許琦華，廖冰靈

(上海中醫藥大學附屬第七人民醫院，上海 200137)

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是一種死亡率較高的惡性腫瘤[1-3]，在我國消化道惡性腫瘤中排第三位，且發病率有持續升高的趨勢。目前，CRC還沒有特異性的腫瘤標志物可供檢測[4]，因此，在早期的診斷上并不靈敏。脯氨酰4-羥化酶β亞基(prolyl-4-hydroxylase subunit beta，P4HB)是一種與內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)密切相關的蛋白。當內質網出現未折疊蛋白應答反應(unfolded protein response，UPR)時，P4HB的表達量會上調并且聚集在ER中[5]。近期有研究[6]表明，P4HB的表達上調與多種癌癥的進展和臨床狀態相關。例如，在膠質瘤細胞中，惡性腫瘤中的P4HB表達有顯著上調，同時P4HB的上調也導致膠質瘤細胞的耐藥性增加[7-8]；在非小細胞肺癌中，P4HB的表達量越低，癌癥的治療效果越好[9]。這些結果提示，P4HB是一個潛在的致癌基因，并在腫瘤的發生、發展中起到重要的作用。目前有關P4HB的表達與結直腸癌之間的關系還未見明確的研究報道。本研究采集了部分臨床結直腸癌組織樣本，結合結直腸癌細胞系，關注P4HB的表達量，同時建立了P4HB表達量與臨床疾病進展的關系。現報告如下。

1 材料與方法

1.1一般資料

選取上海中醫藥大學附屬第七人民醫院2015年1月至2018年6月收治的136例結直腸癌患者進行實驗。其中，男性患者66例；年齡41～94歲，中位年齡68歲；<55歲患者6例，56～65歲患者17例，66～75歲患者22例，>75歲患者21例。女性患者70例；年齡29～90歲，中位年齡70歲；<55歲患者12例，56～65歲患者15例，66～75歲患者17例，>75歲患者26例。納入標準：(1)未接受任何治療的原發性結直腸癌患者；(2)無嚴重心肺功能障礙和其他嚴重合并癥。排除標準：(1)已行放化療及手術治療者；(2)有其它惡性腫瘤史者。取患者腫瘤組織為實驗組；癌旁組織為對照組進行后續檢測。

1.2 細胞系及其培養

實驗所用結直腸癌細胞系HT29、SW620、SW480、LOVO、HCT116、COLO 205、DLD-1等7種細胞系，人正常結直腸粘膜細胞FHC均為本實驗室前期保存。所有細胞系均使用含10%胎牛血清(FBS;Invitrogen，USA)/100 U/mL青霉素(Invitrogen)和100 μg/mL鏈霉素的培養液(dulbecco modified eagle’s medium，DMEM)，于37 ℃，5% CO2培養箱中培養。

1.3 RNA的提取、反轉錄以及qPCR

將待測樣本切小塊約5 mg混合，每管約50 mg，采用TRI Reagent(Sigma Aldrich，T9424)RNA快速提取試劑提取組織總RNA，瓊脂糖凝膠電泳驗證質量后，進行反轉錄以及后續的實時定量PCR。采用反轉錄試劑盒(Promega，A5000)配置反轉錄體系20 μL，混合后水浴，進行反轉錄，反轉錄流程為42 ℃ 60 min、70 ℃ 15 min，產物備用。

按照20 μL配置反應體系，SYBR Green PCR Master Mix 10 μL(TOYOBO)、上下游引物各0.5 μL(10 μM)、反轉錄產物1 μL、ddH2O 8 μL。配置完成后，振蕩器震蕩均勻，加入八連管后，掌上離心機離心數秒再次混勻。實驗所用qPCR引物見表1，序列來自Primer Bank，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.4 樣品總蛋白提取及Western Blot

細胞或樣本加入適量RIPA裂解液后勻漿，冰上靜置0.5 h后，12 000 rpm 4 ℃離心15 min，轉移上清至新的1.5 mL EP管中。將30例患者樣本每例取2 μL混合，振蕩器震蕩均勻后作為Western Blot檢測樣本。健康組織同上處理。向樣品中加入15 μL 5×上樣緩沖液，振蕩器混勻后，置于沸水中水浴5 min，-20 ℃冰箱中保存待用。

表1 qPCR所用引物

取預制膠置于電泳緩沖體系中，每個樣品上樣15 μL，進行電泳，條件為濃縮膠20 mA，分離膠35 mA。電泳結束后，把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質電泳轉移到硝酸纖維膜上，條件為100 mA 40 min。將轉移結束的膜置入5 %牛奶中封閉1 h，孵育一抗過夜。洗膜，孵育二抗，孵育結束后洗膜，進行顯色反應，暗室中以X光片進行成像。所用一抗采購于Abcam公司，P4HB抗體的貨號為ab2792。1.5樣本采集及免疫組織化學檢測

患者一旦確診即采集腫瘤組織及癌旁組織。組織標本使用福爾馬林固定，然后按照標準程序進行石蠟包埋(常溫儲存)并進行病理確診。常規石蠟組織切片，厚3 μm，襯于涂膠玻片上，放置烤箱中(65 ℃)烘烤過夜；組織切片經二甲苯脫蠟3 min×3次，100%、95%和75%的酒精脫水各2 min，自來水沖洗2 min；3%過氧化氫消除內源性過氧化物酶，浸泡10 min，PBS沖洗3 min×3次；EDTA 抗原修復：不銹鋼鍋內加入配制好的EDTA緩沖液，電磁爐上加熱至煮沸，將切片置于耐高溫塑料切片架中，浸入已沸騰的緩沖液中，蓋好加壓閥，保溫20 min，停止加熱，不銹鋼鍋自然冷卻2～3 min，自來水沖洗冷卻至室溫，打開鍋蓋，取出切片，水洗2 min，PBS沖洗3 min×3 次；IHC油筆在組織外圍劃圈，防止滴加的抗體流失；滴加第一抗體(HER2抗體，抗體濃度1∶150)，以PBS緩沖液替代第一抗體，作為空白對照，37 ℃濕盒內孵育2.5 h(或過中午)，PBS沖洗3 min×3次；甩去PBS溶液，滴加即用型二抗，室溫孵育30 min，PBS沖洗 3 min×3 次；滴加新鮮配制的DAB顯色液，鏡下控制顯色時間1～3 min，不超過5 min，水洗2 min；改良無酒精Carazzi蘇木素液復染數秒，流水洗5 min；顯色片過酒精后烤干，用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

根據修訂的 Hercep Test 評分系統進行評分：無著色/少于10%腫瘤細胞有著色(0/陰性)；>10%的腫瘤細胞呈現微弱、不完整著色(1+/陰性)；>10%的腫瘤細胞呈現弱至中度完整/基底側著色(2+/陽性)；>10%的腫瘤細胞呈現強的、完整/基底側著色(3+/陽性)。IHC 判讀的輔助方法(放大倍數規則)：裸眼或低倍鏡下(2.5×/5×)可見強著色為3+；中倍鏡下(10×/20×)可見弱/中等強度著色為2+；高倍鏡下(20×/40×)著色隱約可見為 1+；高倍鏡下(40×)無著色則為陰性。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 結直腸癌細胞中P4HB表達情況

首先檢測了7種結直腸癌細胞系HT29、SW620、SW480、LOVO、HCT116、COLO205、DLD-1，與人正常結直腸黏膜細胞FHC中P4HB的轉錄情況，結果見圖1。研究發現，在7種結直腸癌細胞系中，P4HB的轉錄水平均有不同程度的上調，為1.8～5倍，最高的為SW480細胞系。

采用Western Blot的方法檢測了7種結直腸癌細胞系HT29、SW620、SW480、LOVO、HCT116、COLO205、DLD-1與人正常結直腸黏膜細胞FHC中P4HB的表達情況，見圖2A。研究發現，P4HB在結直腸癌細胞系中均有高表達，而在FHC這一正常細胞系中表達較低。經過灰度掃描比對(圖2B)，可以直觀地看到P4HB在不同的結直腸癌細胞系中的表達量約為正常細胞的2～5倍，最高的為SW480細胞，可達4.9倍。Western Blot的結果與qPCR的結果符合的較好，說明在結直腸癌細胞系中P4HB表達上調。

2.2 結直腸癌組織中P4HB表達情況

根據2.1中研究可推斷P4HB在結直腸癌患者中可能也有高表達的情況，為了驗證這一猜測，本研究檢驗了2017年至2018年6月收治的42例結直腸癌患者腫瘤組織樣本及其癌旁組織樣本，進行qPCR檢測，見圖3。此處將相對表達倍數>1.4倍的樣本認為P4HB高表達。可見結直腸癌患者的癌癥組織中P4HB高表達，差異有統計學意義(P<0.001)。42例癌旁組織中，檢測結果并未發現高表達；42例患者腫瘤組織中，高表達的樣本有28例，不滿足高表達條件的腫瘤樣本有14例，最高相對表達量為對照癌旁組織的10倍左右。

采用Western Blot的方法檢測了6例結直腸癌患者的新鮮腫瘤組織與2例癌旁組織中P4HB的表達情況，見圖4A。研究發現，P4HB在結直腸癌患者的腫瘤組織中均有高表達，而在癌旁組織中表達較低。經過灰度掃描比對(圖4B)，可以直觀地看到P4HB在結直腸癌患者的新鮮腫瘤組織的表達量約為癌旁組織的2倍。Western Blot的結果與qPCR的結果符合的較好，說明在結直腸癌腫瘤組織中P4HB表達上調。

2.3 P4HB表達與患者臨床特征的關系

將136例患者的病理切片進行Hercet評分，得分>2分的患者定義為P4HB高表達。然后，檢驗P4HB表達情況與患者臨床特征的關系，分別驗證了性別、年齡和癌癥分化程度3個因素。檢驗結果見表2。從表中分析的結果可知，性別因素與P4HB的高表達無關，χ2=0.064，P=0.800，差異無統計學意義；年齡因素與P4HB的高表達無關，χ2=0.026，P=0.873，差異無統計學意義；腫瘤分化程度與P4HB的高表達相關，中分化和高分化癌癥患者P4HB高表達的例數顯著上升，χ2=14.931，P=0.001，差異有統計學意義。

表2 P4HB表達與臨床特征的關系

3 討論

本研究發現，P4HB在結直腸癌中顯著高表達，且與腫瘤的分化程度密切相關，是潛在的結直腸癌診斷標志物。P4HB在結直腸癌組織中的高表達可能是由于腫瘤微環境的惡劣引起的。腫瘤細胞常常暴露在營養缺乏以及缺氧的環境下，這一條件將會導致內質網應激(ERS)的出現，觸發防御機制UPR，從而保證腫瘤細胞在ERS下的生存[10]。多篇文獻[11]報道ERS導致UPR發生，而UPR的發生將導致P4HB表達的上調[12]。P4HB是一種重要的ER分子伴侶，傳統上認為其主要功能是負責ER中蛋白質的翻譯后修飾，在調節細胞增殖、凋亡和免疫方面至關重要[13]。由于ER與其他多種細胞器相連，ER的分子伴侶可以在ER外對腫瘤細胞的信號通路進行作用[12,14]，改善腫瘤生存狀況。從這些已經報道的結果中猜測，P4HB是結直腸癌細胞耐受免疫環境、維持增殖和分化的重要分子，是潛在的致癌靶點。P4HB在結直腸癌的發展、分化、遷移和侵襲中發揮重要作用，可以通過過表達/敲減的方法進一步驗證。同時，建立P4HB表達與病人預后也是下一步的研究目標。

在本研究中，結直腸癌患者的癌癥組織P4HB有高表達，并且與腫瘤的惡性分化密切相關，可以作為結直腸癌診斷和治療過程中潛在的分子標志物。這可能是由于高分化/中分化的結直腸癌腫瘤細胞在缺血、缺氧的環境誘導下，出現了嚴重的ERS反應，導致P4HB表達的增加，改善了腫瘤細胞對環境的耐受性，緩解了ERS帶來的不良影響，進一步分化。