丙泊酚通過抑制lncRNA ANRIL抑制非小細胞肺癌細胞增殖與遷移

秦妮娜，陳鍇，劉磊

(1.延安大學附屬醫院麻醉科；2.延安大學附屬醫院腫瘤科二病區，陜西 延安 716000)

肺癌在全球惡性腫瘤的發病率和死亡率均具第一位，包括小細胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，后者約占總數80%[1]，為主要類型。手術治療是NSCLC的主要根治方法，但很多患者確診時失去了手術治療的時機和指征。有研究[2]顯示，NSCLC患者五年的生存率仍僅為15%，這主要是因為大多數NSCLC患者在就診時已是晚期，從而增加了NSCLC致死的可能。丙泊酚的正式名稱為2，6-二異丙基苯酚，為臨床上常見的靜脈麻醉藥物，具有起效迅速、作用時間短、可控性強、清醒快而完全、副作用少等特點[3]。李柏森等[4]研究發現，丙泊酚具有抑制腫瘤增殖的作用，可阻止MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白的表達，從而抑制胃癌細胞的增殖與遷移，但對NSCLC細胞的影響尚無相關報道。長鏈非編碼RNA-RNALL(lncRNA ANRIL)是一種長度≥200 ntt的RNA，在多種惡性腫瘤中異常表達，并與腫瘤細胞增殖與遷移等生物學過程密切相關[5]，能在轉錄后調控、表觀遺傳學、轉錄調控等方面調控基因的表達水平，與NSCLC的增殖、浸潤、轉移關系密切，但是具體的作用機制尚不明確[6-7]。本研究旨在探討了丙泊酚在通過抑制lncRNA ANRIL抑制非小細胞肺癌細胞增殖與遷移中的價值。

1 材料與方法

1.1 材料

人NSCLC A549細胞系購自中國科學院上海細胞庫。丙泊酚注射液購自意大利AstraZeneca公司；RPMI-1640培養基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；Annexin V FITC/PI細胞凋亡試劑盒購自上海生工公司；MTT檢測試劑盒購自日本同仁公司；Matrigel基質膠和Transwell小室購自美國BD公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組與處理 A549細胞用含有10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養基進行培養，培養條件：5% CO2、37 ℃，培養2～3 d進行傳代，待細胞長至80%融合時進行后續實驗。實驗1組與實驗2組加入100 μmol、1 000 μmol丙泊酚(溶劑DMSO濃度為5%)100 μL，對照組加入5%DMSO 100 μL繼續進行培養，處理后8 h進行換液。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖 處理后24 h、48 h，將細胞以5×103個細胞/孔種植于96孔板中，每孔加入20 μL 0.5 mg/mL MTT溶液，繼續培養6 h后終止培養，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min后，用酶標儀于540 nm波長處檢測光密度值，計算增殖活性。

1.2.3 Annexin-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡 處理后24 h、48 h，1×106細胞密度接種于6孔培養板中，調整細胞濃度為5×105/mL左右，取200 μL的細胞懸液加入10 μL 的Annexin-FITC，再加入10 μL濃度20 μg/mL的PI錠，室溫避光孵育10 min，重懸細胞，采用流式細胞儀記錄細胞凋亡率。

1.2.4 Transwell檢測細胞遷移 處理后48 h，將細胞以3.4×104接種于transewell小室的上室中，下層加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基600 μL，將Transwell小室放進24孔板里，培養24 h后取出Transwell小室，采用多聚甲醛固定并用蘇木素染色，顯微鏡下計數遷移距離與過膜細胞數。

1.2.5 實時定量PCR檢測lncRNA ANRIL表達 處理后24 h、48 h，收集細胞，細胞總RNA均采用TRIzol法提取。LncRNA-ANRIL上游引物為：5′-TCATGATGGAATTGGAGCCTT-3′；下游引物為：5′-CTCTTCCTGGCTTGCAGATTG-3′。以U2作為內標，檢測lncRNA ANRIL相對表達水平。

上述實驗都重復3次，取平均值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 lncRNA ANRIL表達對比

處理后24 h、48 h，實驗2組與實驗1組的lncRNA ANRIL表達水平顯著低于對照組(P<0.05)，實驗2組低于實驗1組(P<0.05)。見表1。

組別24 h48 h對照組(n=3)3.22±0.454.32±0.51實驗1組(n=3)1.23±0.33*1.11±0.32*實驗2組(n=3)0.67±0.29*#0.57±0.21*#F值40.87190.967P值<0.001<0.001

*P<0.05，與對照組相比；#P<0.05，與實驗1組相比。

2.2 細胞增殖指數對比

處理后24 h、48 h，實驗2組與實驗1組的細胞增殖指數顯著低于對照組(P<0.05)，實驗2組低于實驗1組(P<0.05)。見表2。

組別24 h48 h對照組(n=3)76.49±6.1592.79±5.21實驗1組(n=3)54.32±4.39*56.26±6.14*實驗2組(n=3)24.59±5.01*#30.92±4.81*#F值74.25698.962P值<0.001<0.001

*P<0.05，與對照組相比；#P<0.05，與實驗1組相比。

2.3 細胞凋亡率對比

處理后24 h、48 h，實驗2組與實驗1組的細胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.05)，實驗2組也高于實驗1組(P<0.05)。見表3。

表3 三組處理后不同時間點的細胞凋亡率對比

*P<0.05，與對照組相比；#P<0.05，與實驗1組相比。

2.4 細胞遷移情況對比

轉染48 h后，實驗2組與實驗1組的遷移距離與過膜細胞數都顯著少于對照組(P<0.05)，實驗2組顯著少于實驗1組(P<0.05)。見表4。

表4 三組處理后的細胞遷移與侵襲情況對比

*P<0.05，與對照組相比；#P<0.05，與實驗1組相比。

3 討論

NSCLC對人們健康的威脅日益嚴重，其發生、發展和侵襲轉移是一個涉及多因素、多過程、多步驟的復雜漫長過程，抑癌基因的缺失或表達失調是NSCLC發生與發展的主要原因之一。當前，雖然治療方法與藥物不斷推陳出新，但患者的5年生存率依然沒有顯著提高。因此，尋找影響NSCLC發生與發展的分子標志物，對早期診治NSCLC具有重要的價值。

lncRNA ANRIL是一類長度≥200 nt的RNA，在核內運輸、染色體修飾、轉錄沉默、轉錄激活等方面均具有重要的功能[8]，作為一類新型的具有生物學功能的臨床標志物，其具有非常廣闊的臨床應用前景，對疾病的發生、發展及治療有重要作用。已有研究[9]顯示，在胃癌細胞中發現lncRNA ANRIL異常高表達，并且與腫瘤大小、細胞分化和胃癌患者生存時間顯著相關。特別是lncRNA ANRIL通過抑制上皮-間質轉化過程調控舌鱗狀細胞癌，目前關于其在胃癌中的表達水平及功能作用尚不明確[10]。丙泊酚是一種強有效的抗氧化劑，也是一種強有效的血管擴張劑和支氣管舒張劑，能夠抑制心肌細胞鈣內流并且提高心肌細胞肌絲的敏感性。有研究[11-12]證明，丙泊酚可通過抑制ERK1/2活化的途徑，從而抑制結腸癌細胞的侵襲性；還可顯著抑制乳腺癌細胞的粘附、轉移并誘導細胞凋亡，可輔助發揮乳腺癌的治療作用。本研究顯示，處理后24 h、48 h，實驗2組與實驗1組的lncRNA ANRIL表達水平、細胞增殖指數顯著低于對照組，實驗2組也低于實驗1組，說明丙泊酚能抑制lncRNA ANRIL表達，從而抑制NSCLC細胞增殖，且濃度為1 000 μmol作用更顯著，提示丙泊酚具有抗癌作用，主要是丙泊酚能通過調控多條信號通路及lncRNA的表達抑制癌細胞的生存，從而發揮抑癌作用。

NSCLC是最常見的惡性腫瘤之一，盡管傳統的治療技術不斷提升，但其5年生存率依然不足15%，為此尋找新的治療方法具有重要價值。丙泊酚是臨床上常見使用的靜脈麻醉藥，由于具有抗神經細胞凋亡作用，從而可發揮神經保護作用。體外實驗表明，在肺癌細胞中，丙泊酚可抑制癌NSCLC細胞的侵襲和遷移，引起NSCLC的化療增敏作用[13]。本研究顯示,處理后24 h、48 h，實驗2組與實驗1組的細胞凋亡率顯著高于對照組，實驗2組也高于實驗1組，表明丙泊酚能促進NSCLC細胞凋亡。也有研究[14]顯示，急性早幼粒細胞白血病細胞暴露于丙泊酚后，可促使凋亡小體的形成，導致抑制細胞生長。特別是低濃度丙泊酚可能通過促進NSCLC細胞凋亡相關蛋白Bax的表達，促進細胞凋亡；較高濃度的丙泊酚可能通過促進凋亡蛋白酶Caspase-3的表達，也可促進細胞凋亡。但是，高濃度的促進凋亡效果顯著，說明高濃度的丙泊酚可以同時作用于多條凋亡信號通路來促進NSCLC細胞凋亡。

異常表達的lncRNAs對NSCLC的發展發展起重要的調控作用。lncRNA ANRIL可通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進NSCLC的發展過程。lncRNA ANRIL還通過調節miRNA信號通路誘導EMT，從而促進肝癌細胞的侵襲轉移。本研究顯示轉染48 h后，實驗2組與實驗1組的遷移距離與過膜細胞數都顯著少于對照組，實驗2組也顯著少于實驗1組，表明丙泊酚減弱了細胞的侵染和轉移能力，抑制NSCLC細胞的遷移。不過丙泊酚對NSCLC的調控作用是一個多因素多步驟的過程，除了轉錄因子外，miRNA、組蛋白修飾、DNA甲基化、核苷酸

糖代謝位等因素都可能在其中發揮了相應的作用[15]。同時本研究也有一定的不足，丙泊酚與lncRNA ANRIL更深入的功能及潛在的分子機制仍不明確，對相關的信號通路分子，蛋白分子沒有研究，需進一步探索。

綜上所述，丙泊酚能通過抑制lncRNA ANRIL的表達，從而抑制NSCLC細胞增殖與遷移，促進其凋亡，從而發揮抑癌作用。