青蒿虎酯對人急性髓系白血病原代細胞及其細胞株K562增殖和凋亡的影響研究

王朦，賈國存，成怡冰，王海軍，劉煒，郭亞瓊

急性髓系白血病（AML）是一組臨床及生物學特征均具有異質性的惡性疾病，好發于兒童，占急性白血病的20%～25%［1]。隨著危險度分層指導個體化治療的廣泛應用，兒童AML的預后較以往大幅改善，誘導化療總體完全緩解率可達85%～90%，且5年總生存率已上升至60%～75%［2]。但仍有部分AML患兒誘導化療病情難以緩解或出現復發，AML長期治療仍面臨著高復發率、治療相關死亡風險、化療相關毒副作用等多重挑戰［3-4]。青蒿素為我國學者首次從菊科植物黃花蒿中提取的化合物，青蒿琥酯為青蒿素類衍生物，為中國自主研發的具有倍半萜結構的青蒿素類抗瘧特效藥。近年來，大量實驗研究發現其對白血病、口腔癌、膀胱癌、宮頸癌等多種疾病均具有較強的抑制作用［5-6]，對白血病也有高度敏感性，且毒副作用小、易耐受，并與傳統化療藥物不存在交叉耐藥作用［7]，這為研究開發經濟、有效的AML治療藥物提供了新的線索。基于此，本文擬觀察不同濃度的青蒿琥酯對AML原代細胞與細胞株K562的增殖抑制及促凋亡作用，以期為進一步明確AML的發病機制及青蒿琥酯的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究材料 AML兒童納入標準：（1）經細胞形態學、組織化學染色及流式細胞免疫學分型確診；（2）初治或復發AML；（3）患兒家屬均對本研究內容知情且簽署知情同意書；（4）臨床診治資料完善。

采用密度梯度法分離2016年10月—2018年10月于河南省兒童醫院血液科就診的符合納入標準的24例初治或復發AML患兒的骨髓液4～5 ml，加入抗凝離心管（含肝素0.3 ml），取等體積磷酸緩沖鹽溶液（PBS）將骨髓液稀釋，充分混勻。取淋巴細胞分離液4～5 ml加入干燥離心管中，再緩慢將稀釋后的骨髓液加入分離液上層，2500 r/min離心20 min（離心半徑為15 cm），取中間單個核細胞層，移入干潔離心管中，用PBS漂洗2次，1000 r/min離心5 min（離心半徑為15 cm），棄上清液，37 ℃、95%飽和濕度、5% CO2條件下RPMI 1640培養基中培養，每3 d換液1次。調整密度為1×106/ml，取處于對數生長期、細胞活性＞95%的細胞進行實驗。入選的24例初治或復發AML患兒FAB分型均為M1型，其中男13例，女11例；年齡（7.2±1.6）歲；正常核型AML 8例，異常核型AML 16例。

AML細胞株K562購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心。培養于含10%胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素、100 μg/ml青霉素的RPMI 1640培養液中，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，1～2 d換液。

1.2 主要儀器與試劑 5417低溫高速離心機（德國Eppondoff公司）；倒置顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）；FACSCaliber流式細胞儀（美國BD公司）。

注射用青蒿琥酯粉針劑（廣西桂林南藥股份有限公司）；RPMI1640細胞培養基（美國Gibco公司）；胎牛血清；四甲基偶氮唑鹽（MTT）（美國Sigma公司）。

1.3 藥物配置及實驗分組 無菌條件下，將青蒿琥酯粉針劑加入所附5% NaHCO3溶液1 ml中，振搖1 min使其充分溶解，注入RPMI 1640培養液5 ml，充分混勻，則青蒿琥酯濃度為10 mg/ml。取上述青蒿琥酯液1 ml加入終體積為10 ml的RPMI 1640培養液中，充分混勻，則青蒿琥酯濃度為1 mg/ml；參照此方法分別配備3種濃度（12.5、25.0、50.0 μg/ml）的青蒿琥酯液均于-20 ℃冰箱保存備用。

AML原代細胞及細胞株K562均分為對照組和實驗組（依次為對照組1和實驗組1，對照組2和實驗組2），其中對照組1及對照組2不予青蒿琥酯干預，實驗組1和實驗組2分別添加終濃度為12.5、25.0、50.0 μg/ml的青蒿琥酯液（分別記為終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實驗亞組1及終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實驗亞組2）。

本研究價值：

（1）當前仍有部分急性髓系白血病（AML）患兒經常規治療后出現復發或難以緩解的現象。青蒿素為我國學者首次從菊科植物黃花蒿中提取的化合物，青蒿琥酯為青蒿素類衍生物，為中國自主研發的具有倍半萜結構的青蒿素類抗瘧特效藥。但現階段青蒿琥酯對白血病細胞的增殖抑制及促凋亡作用機制尚不清楚。

（2）王朦等得出青蒿琥酯能夠有效抑制AML原代細胞、細胞株K562的增殖并誘導其凋亡，該結果為青蒿琥酯作為AML治療新的靶點提供了實驗依據，有望推動青蒿琥酯的進一步研究。

（3）本研究雖然證實青蒿琥酯能夠有效抑制AML原代細胞及細胞株K562的增殖并誘導其凋亡，但其具體機制仍未闡述，尚需進一步研究。

1.4 采用細胞計數法觀察AML原代細胞、細胞株K562細胞生存情況 分別吸取干預前、干預后24 h、干預后48 h、干預后72 h懸浮細胞10 μl置入干燥塑料離心管，加入0.2%臺盼藍染色液10 μl混勻，染色約1 min，經過染色的細胞懸液從細胞計數板的一側緩慢加入細胞計數板，使懸液充滿蓋玻片，靜置3 min。在低倍顯微鏡下（×100）觀察計數板細胞數。其中呈藍色染色的細胞為死亡細胞，而不染色的細胞為活細胞。細胞存活率=（細胞總數-藍色細胞數）/細胞總數×100%。

1.5 采用MTT法檢測AML原代細胞、細胞株K562生長抑制情況 各組加入不同濃度青蒿琥酯液后繼續在細胞培養箱中孵育，一板孵育48 h，一板孵育72 h。每板在終止培養前4 h每孔加入50 μl濃度為5 mg/ml的MTT，繼續孵育4 h，使MTT還原為甲臜，取出96孔板，置于平板離心機，1000 r/min離心5 min（離心半徑為15 cm），棄上清液，每孔加二甲基亞砜150 pl，于微型混合器振蕩10 min，使結晶完全溶解，置酶聯免疫檢測儀下測定吸光度（A）值。細胞生長抑制率（%）=（1-A干預/A對照）×100%。

1.6 采用流式細胞術檢測AML原代細胞、細胞株K562凋亡情況 各組細胞分別在培養24 h、48 h、72 h后收集，取1×106個細胞，用預冷的PBS洗2次，然后加入10 μl的AnnexinV緩沖液懸浮細胞，各管中分別加入5 μl AnnexinV，5 μl 碘化丙啶混勻，避光放置15 min，再加AnnexinV緩沖液500 μl，2000 r/min離心5 min（離心半徑為15 cm），采用FACSCalibur流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.7 統計學方法 采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以（±s）表示，多組間細胞存活率、生長抑制率、凋亡率比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對照組1及實驗組1各亞組干預不同時間點AML原代細胞存活率比較 對照組1及終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實驗亞組1干預24 h AML原代細胞存活率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；對照組1及終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實驗亞組1干預48 h、72 h AML原代細胞存活率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。其中終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實驗亞組1干預48 h、72 h AML原代細胞存活率低于對照組1，差異有統計學意義（P＜0.05）；終濃度25.0、50.0 μg/ml實驗亞組1干預72 h AML原代細胞存活率低于終濃度12.5 μg/ml實驗亞組1，差異有統計學意義（P＜0.05）；終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實驗亞組1干預48 h AML原代細胞存活率兩兩比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；終濃度25.0、50.0 μg/ml實驗亞組1干預72 h AML原代細胞存活率比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表1）。

表1 對照組1及實驗組1各亞組干預不同時間點AML原代細胞存活率比較（±s，%，n=3）Table 1 Comparison of survival rates of primary AML cells in control group 1 and experimental subgroup 1 at different intervals

表1 對照組1及實驗組1各亞組干預不同時間點AML原代細胞存活率比較（±s，%，n=3）Table 1 Comparison of survival rates of primary AML cells in control group 1 and experimental subgroup 1 at different intervals

注：與對照組1比較，aP＜0.05；與終濃度12.5 μg/ml實驗亞組1比較，bP＜0.05

組別 24 h 48 h 72 h對照組185.74±4.3173.21±3.2073.45±3.35終濃度12.5 μg/ml實驗亞組185.60±4.3844.59±5.34a 13.62±1.32a終濃度25.0 μg/ml實驗亞組184.63±4.3543.62±6.56a 8.06±1.54ab終濃度50.0 μg/ml實驗亞組183.55±3.7939.56±6.88a 6.44±1.69ab F值 0.34844.4491366.590 P值 0.791 ＜0.001 ＜0.001

2.2 對照組2及實驗組2各亞組干預不同時間點AML細胞株K562存活率比較 對照組2及終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實驗亞組 2干預 24 h AML細胞株K562存活率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；對照組2及終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實驗亞組2干預48 h、72 h AML細胞株K562存活率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。其中終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實驗亞組2干預48 h、72 h AML細胞株K562存活率低于對照組2，差異有統計學意義（P＜0.05）；終濃度25.0、50.0 μg/ml實驗亞組2干預72 h AML細胞株K562存活率低于終濃度12.5μg/ml實驗亞組2，差異有統計學意義（P＜0.05）；終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實驗亞組2干預48 h AML細胞株K562存活率兩兩比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；終濃度25.0、50.0 μg/ml實驗亞組2干預72 h AML細胞株K562存活率比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表2）。

表2 對照組2及實驗組2各亞組干預不同時間點AML細胞株K562存活率比較（±s，%，n=3）Table 2 Survival rate of AML K562 cell line at different intervals in control group 2 and experimental subgroup 2

表2 對照組2及實驗組2各亞組干預不同時間點AML細胞株K562存活率比較（±s，%，n=3）Table 2 Survival rate of AML K562 cell line at different intervals in control group 2 and experimental subgroup 2

注：與對照組2比較，aP＜0.05；與終濃度12.5 μg/ml實驗亞組2比較，bP＜0.05

組別 24 h 48 h 72 h對照組286.06±7.2275.87±5.4276.20±5.43終濃度12.5 μg/ml實驗亞組285.61±5.3341.56±5.01a 12.56±2.01a終濃度25.0 μg/ml實驗亞組284.43±4.1137.23±5.30a 7.23±1.30ab終濃度50.0 μg/ml實驗亞組284.70±4.7234.23±5.34a 5.23±1.34ab F值 0.11780.762725.746 P值 0.949 ＜0.001 ＜0.001

2.3 對照組1及實驗組1各亞組干預不同時間點AML原代細胞生長抑制率比較 對照組1及終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實 驗 亞 組 1干 預 24 h、48 h、72 h AML原代細胞生長抑制率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。其中終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實驗亞組1干預24 h、48 h、72 h AML原代細胞生長抑制率高于對照組1，差異有統計學意義（P＜0.05）；終濃度25.0、50.0 μg/ml實驗亞組1干預48 h、72 h AML原代細胞生長抑制率高于終濃度12.5 μg/ml實驗亞組1，差異有統計學意義（P＜0.05）；終濃度25.0、50.0 μg/ml實驗亞組1干預48 h、72 h AML原代細胞生長抑制率比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表3）。

表3 對照組1及實驗組1各亞組干預不同時間點AML原代細胞生長抑制率比較（±s，%，n=3）Table 3 Comparison of growth inhibition rates of AML stem cells in control group 1 and experimental subgroup 1 at different intervals

表3 對照組1及實驗組1各亞組干預不同時間點AML原代細胞生長抑制率比較（±s，%，n=3）Table 3 Comparison of growth inhibition rates of AML stem cells in control group 1 and experimental subgroup 1 at different intervals

注：與對照組1比較，aP＜0.05；與終濃度12.5 μg/ml實驗亞組1比較，bP＜0.05

組別 24 h 48 h 72 h對照組11.83±0.342.43±0.543.31±0.51終濃度12.5 μg/ml實驗亞組114.50±2.97a 16.79±3.27a 19.33±3.80a終濃度25.0 μg/ml實驗亞組115.36±4.34a 33.32±6.41ab 45.54±8.55ab終濃度50.0 μg/ml實驗亞組116.39±5.40a 34.56±6.22ab 47.96±7.37ab F值 19.70661.33278.049 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 對照組2及實驗組2各亞組干預不同時間點AML原代細胞生長抑制率比較 對照組2及終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實 驗 亞組 2干 預 24 h、48 h、72 h AML原代細胞生長抑制率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。其中終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實驗亞組2干預24 h、48 h、72 h AML原代細胞生長抑制率高于對照組2，差異有統計學意義（P＜0.05）；終濃度25.0、50.0 μg/ml實驗亞組2干預48 h、72 h AML原代細胞生長抑制率高于終濃度12.5 μg/ml實驗亞組2，差異有統計學意義（P＜0.05）；終濃度25.0、50.0 μg/ml實驗亞組2干預48 h、72 h AML原代細胞生長抑制率比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表4）。

表4 對照組2及實驗組2各亞組干預不同時間點AML細胞株K562生長抑制率比較（±s，%，n=3）Table 4 Comparison of the inhibition rate of AML K562 cell growth between control group 2 and experimental subgroup 2 at different intervals

表4 對照組2及實驗組2各亞組干預不同時間點AML細胞株K562生長抑制率比較（±s，%，n=3）Table 4 Comparison of the inhibition rate of AML K562 cell growth between control group 2 and experimental subgroup 2 at different intervals

注：與對照組2比較，aP＜0.05；與終濃度12.5 μg/ml實驗亞組2比較，bP＜0.05

組別 24 h 48 h 72 h對照組22.53±0.574.10±0.885.66±0.86終濃度12.5 μg/ml實驗亞組215.63±3.42a 19.40±3.76a 22.15±5.00a終濃度25.0 μg/ml實驗亞組217.26±5.33a 30.03±7.39ab 43.73±7.79ab終濃度50.0 μg/ml實驗亞組217.30±4.80a 34.87±7.96ab 44.75±8.65ab F值 19.29033.54752.426 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.5 對照組1及實驗組1各亞組干預48 h AML原代細胞凋亡率比較 對照組1及終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實驗亞組1干預48 h AML原代細胞凋亡率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。其中終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實驗亞組1干預48 h AML原代細胞凋亡率高于對照組1，差異有統計學意義（P＜0.05）；終濃度25.0、50.0 μg/ml實驗亞組1干預48 h AML原代細胞凋亡率高于終濃度12.5 μg/ml實驗亞組1，差異有統計學意義（P＜0.05）；終濃度25.0、50.0 μg/ml實驗亞組1干預48 h AML原代細胞凋亡率比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表5）。

表5 對照組1及實驗組1各亞組干預48 h AML原代細胞凋亡率比較（±s，%，n=3）Table 5 Comparison of apoptotic rate of AML stem cells in control group 1 and experimental subgroup 1 after 48 hours of intervention

表5 對照組1及實驗組1各亞組干預48 h AML原代細胞凋亡率比較（±s，%，n=3）Table 5 Comparison of apoptotic rate of AML stem cells in control group 1 and experimental subgroup 1 after 48 hours of intervention

注：與對照組1比較，aP＜0.05；與終濃度12.5 μg/ml實驗亞組1比較，bP＜0.05；AML=急性髓系白血病

組別 AML原代細胞對照組13.90±0.87終濃度12.5 μg/ml實驗亞組134.78±7.80a終濃度25.0 μg/ml實驗亞組146.32±8.23ab終濃度50.0 μg/ml實驗亞組147.44±8.12ab F值 50.634 P值 ＜0.001

2.6 對照組2及實驗組2各亞組干預48 h AML原代細胞凋亡率比較 對照組2及終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實驗亞組2干預48 h AML原代細胞凋亡率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實驗亞組2干預48 h AML原代細胞凋亡率高于對照組2，差異有統計學意義（P＜0.05）；終濃度25.0、50.0 μg/ml實驗亞組2干預48 h AML原代細胞凋亡率高于終濃度12.5 μg/ml實驗亞組2，差異有統計學意義（P＜0.05）；終濃度25.0、50.0 μg/ml實驗亞組2干預48 h AML原代細胞凋亡率比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表6）。

表6 對照組2及實驗組2各亞組干預48 h AML細胞株K562凋亡率比較（±s，%，n=3）Table 6 Comparison of apoptotic rate of AML K562 cell in control group 2 and experimental subgroup 2 after 48 h of intervention

表6 對照組2及實驗組2各亞組干預48 h AML細胞株K562凋亡率比較（±s，%，n=3）Table 6 Comparison of apoptotic rate of AML K562 cell in control group 2 and experimental subgroup 2 after 48 h of intervention

注：與對照組2比較，aP＜0.05；與終濃度12.5 μg/ml實驗亞組2比較，bP＜0.05

組別 AML細胞株K562對照組22.97±0.66終濃度12.5 μg/ml實驗亞組236.82±7.17a終濃度25.0 μg/ml實驗亞組247.56±8.29ab終濃度50.0 μg/ml實驗亞組247.43±7.92ab F值 58.253 P值 ＜0.001

3 討論

針對白細胞增殖、分化和凋亡的不同信號轉導途徑，臨床已相應研究不同作用途徑的抗白血病藥物，化學合成的抗白血病藥物雖然療效確切，但毒副作用明顯，易產生多藥耐藥性，使許多患者不能耐受，尤其對兒童白血病，耐受性限制了諸多藥物的使用。從祖國龐大的中藥寶庫中尋找、開發高效、低毒的抗白血病制劑有重大臨床意義。既往研究顯示，雷公藤、青黛、大蒜素、蟾酥、葛根等眾多中藥成分均有不同程度抗白血病作用［8-10]。青蒿素作為我國學者首次從菊科植物黃花蒿中提取的化合物，青蒿琥酯為青蒿素類衍生物，為中國自主研發的具有倍半萜結構的青蒿素類抗瘧特效藥，對耐藥的腫瘤細胞也有效，且毒副作用小、患者易耐受［11-13]。對于白血病而言，早期陳偉等［14]、彭宇等［15]研究證實青蒿素及其衍生物對HL60白血病細胞有體外抑制作用，細胞凋亡的誘導作用突出；孫艷美等［16]的研究顯示，與空白對照組比較，青蒿琥酯50、100 μmol/L處理AML細胞株K56248 h后S期細胞減少，G2期、M期細胞增加；當濃度進一步增加后，G2M期細胞減少，但死亡細胞增加到39.65%，且青蒿琥酯可導致細胞內Bax表達明顯增加，由此認為青蒿琥酯可通過誘導細胞凋亡和抑制細胞增殖而發揮抗腫瘤作用，并可能對白血病具有高度敏感性。

本研究主要觀察青蒿素類衍生物青蒿琥酯對AML原代細胞、細胞株K562增殖和凋亡的影響，細胞計數結果顯示，作為對照的AML原代細胞、細胞株K562在干預48、72 h細胞存活率仍在70%以上，而加入不同濃度青蒿琥酯進行干預的組別干預48 h的細胞存活率均降至50%以下，且明顯低于對照；青蒿琥酯終濃度為25.0 μg/ml、50.0 μg/ml的實驗組干預72 h后細胞大量死亡，存活率不足10%，明顯低于青蒿琥酯終濃度為12.5 μg/ml的實驗組及對照組。同時，采用MTT法檢測終濃度為12.5、25.0、50.0 μg/ml的青蒿琥酯對AML原代細胞、細胞株K562作用不同時間后發現，對AML原代細胞、細胞株K562的增殖抑制最適的青蒿琥酯濃度為25.0 μg/ml，表明青蒿琥酯能夠有效抑制AML原代細胞及細胞株K562的增殖，且與濃度和/或時間均有關，也進一步證實了抑制細胞增殖是青蒿琥酯抗白血病的主要機制之一。此外，本研究各實驗組不同濃度青蒿琥酯作用48 h后，AML原代細胞、細胞株K562細胞凋亡率明顯高于相應的對照組，其中終濃度為25.0、50.0μg/ml的青蒿琥酯干預后AML原代細胞、細胞株K562細胞凋亡率明顯高于12.5 μg/ml，這一點與張萍等［17]結果類似，表明青蒿琥酯能夠誘導AML原代細胞及細胞株K562凋亡。李異興等［18]認為青蒿琥酯主要通過降低線粒體跨膜電位促進細胞內凋亡物質的釋放及caspase的激活來誘導細胞凋亡。歐瑞明等［19]認為青蒿琥酯可以通過抑制NF-κB通路或抑制Bcl-2/bax的表達誘導腫瘤細胞凋亡。但青蒿琥酯抑制AML原代細胞及細胞株K562的增殖及誘導細胞凋亡的具體機制仍需進一步探究。

綜上所述，青蒿琥酯能夠有效抑制AML原代細胞、細胞株K562的增殖并誘導其凋亡，該結果為青蒿琥酯作為AML治療新的靶點提供了實驗依據，有望推動青蒿琥酯的進一步研究，為AML的靶向治療奠定基石。