活體成像技術在NK/T細胞淋巴瘤早期檢測中的應用價值研究

劉凡，趙玉，潘新宇，付瑤，于建渤*

淋巴瘤是一組來源于血液淋巴系統的惡性腫瘤，是世界范圍內十大惡性腫瘤之一，好發于亞洲、墨西哥及南美洲，男女發病比率為（3～4）∶1［1-4]。隨著社會發展和腫瘤流行病學因素的變化，淋巴瘤發病年齡已呈現明顯年輕化趨勢，發病率逐年上升，5年生存率不足50%，成為威脅人類生命的一大殺手［5-6]。因此，探索NK/T細胞淋巴瘤早期診斷的新方法，是進一步提高NK/T細胞淋巴瘤患者生存率的關鍵［7-9]。

活體腫瘤動態監測是醫學研究領域的一項重要內容，自1999年美國哈佛大學WEISSLEDER首次提出分子影像學概念至今，分子影像學在世界范圍內取得了長足發展，為精準醫學早期診斷疾病提供了有效技術支持［10-11]。光學分子影像學技術能夠非侵入性、實時監測、定量分析腫瘤模型中腫塊的生長、侵襲、轉移，是發展精準醫學診療的必然方向［12]。

本研究以NK92-Luc裸鼠移植瘤模型為研究對象，以小動物活體成像儀為輔助手段，監測NK/T細胞淋巴瘤動態生長過程，深化活體成像技術（IVIT）在NK/T細胞淋巴瘤早期研究中的應用。

1 材料與方法

1.1 研究材料 NK92-Luc淋巴瘤細胞株由黑龍江省腫瘤重點防治實驗室提供；SPF級雌性BALB/C-nu裸鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；RPMI1640培養基和胎牛血清均購自美國Gibco公司；重組人白介素2（RH IL-2）購自美國R&D公司；嘌呤霉素培養基購自成都思天德生物科技有限公司；螢火蟲熒光素酶鉀鹽D-Luciferin購自美國Xenogen公司；小動物活體成像儀為Berthold Technology-NightOwl LB983；倒置熒光顯微鏡為尼康TS100-F。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和動物飼養 2015年10月—2016年10月，NK92-Luc細胞培養在含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素、89%的RPMI1640培養基、1.5 μg/ml嘌呤霉素培養基中，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中培養。SPF級雌性BALB/C-nu裸鼠，體質量8～15 g，4～6周齡，飼養在SPF級超凈層流室，恒溫（24～26 ℃）飼養，墊料、籠具、飼料及飲水均經過高壓滅菌和紫外線照射處理。

1.2.2 構建裸鼠皮下移植瘤模型 取對數生長期NK92-Luc細胞， 移 入15 ml離心 管離 心（1000 r/min，5 min，r=7 cm），棄上清液，經磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，適量PBS重懸，細胞計數板計數，按照1×106個細胞/只接種密度，配置細胞懸液。將裸鼠固定在超凈工作臺中，75%乙醇溶液消毒裸鼠左側季肋皮膚，按照每只100 μl NK92-Luc細胞懸液（含1×106個細胞）的劑量，在3只裸鼠左側季肋皮下接種。實驗重復3次，隔天觀察裸鼠狀態。

1.2.3 常規方法觀察腫瘤生長動態 接種NK92-Luc細胞后，每天觸摸和目測接種部位，待腫塊可觸及時記為腫瘤出現時間。本研究中，接種腫瘤細胞第5天裸鼠均出現局部皮膚凸起、增厚，接種腫瘤細胞第5、8、11天用游標卡尺測量腫瘤最長徑和垂直方向最大橫徑，計算瘤體積（體積=橫徑2×長徑/2），繪制腫瘤生長曲線。

1.2.4 小動物活體光學成像技術監測裸鼠腫瘤的生長動態 接種腫瘤細胞第5、8、11天，通過小動物活體光學成像儀檢測裸鼠皮下移植瘤的生物發光情況，取3只荷瘤裸鼠（造模和成像監測均為相同的3只裸鼠），腹腔注射50 μl D-Luciferin（1 mg/ml），記錄注射熒光素酶底物時間；在注射D-Luciferin第7 分鐘時將裸鼠放入麻醉箱中進行異氟烷吸入性麻醉；在注射D-Luciferin第9 分鐘時將3只裸鼠整齊放入活體成像儀暗箱平臺，調整控制平臺升降至合適視野，開啟激發光源，采用儀器配備的indigo軟件對圖像和數據進行分析處理；在注射D-Luciferin第14分鐘時獲取成像圖片。計算各區域發出的光子數，檢測發光細胞在活體動物內的靈敏度（參數：曝光時間5 min/次）。

1.2.5 腫瘤肉眼大體觀察和蘇木素-伊紅（HE）組織形態學觀察 在實驗完畢后，采用斷頸法處死裸鼠，剔除腫塊，行肉眼觀察，并快速用微量天平稱重。腫瘤組織切小塊，置于10%中性甲醛溶液中，石蠟包埋切片，HE染色，電鏡下觀察。具體步驟如下：60 ℃烤片40 min；二甲苯脫蠟2次，5 min/次；酒精梯度脫水（依次為100%Ⅰ、100%Ⅱ、95%、85%、75%，各3 min），自來水沖洗；浸入蘇木素液染色5 min，自來水沖洗；1%鹽酸酒精分化30 s；自來水沖洗，靜置顯藍10 min；HE染色3 min，自來水沖洗；酒精梯度脫水（依次為75%、85%、95%、100%Ⅱ、100%Ⅰ，各3 min）；二甲苯透明2次，5 min/次；中性樹膠封片。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，計量資料以（±s）表示。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NK92-Luc細胞培養和形態學觀察 在顯微鏡下，NK92-Luc細胞在培養基中懸浮生長，成簇生長，細胞呈圓形、類圓形（見圖1）。

圖1 普通顯微鏡下NK92-Luc淋巴瘤細胞形態Figure 1 Observation of NK92-Luc cell lymphoma morphology under ordinary microscope

圖2 裸鼠移植瘤模型腫瘤生長曲線Figure 2 Tumor growth curve of the nude mouse model of subcutaneous xenograft tumor

2.2 常規方法觀察腫瘤的生長動態 在接種瘤細胞第5、8、11天腫瘤體積分別為（0.0038±0.0023）、（0.1323±0.0607）、（0.4232±0.0696）mm3； 根據3只裸鼠平均腫瘤體積繪制腫瘤生長曲線，腫瘤體積在前2 d增長不明顯，在第3～5天增長明顯加快，在第6～8天增長速度最快，在第9～11天增長趨向緩和（見圖2）。

2.3 IVIT成像 在接種腫瘤細胞第5天，生物發光成像已經可以檢測到裸鼠皮下腫瘤細胞生物發光信號。隨著接種時間延長，皮下移植瘤體積及其生物發光信號逐漸增強，肉眼可見每只裸鼠左側季肋部接種腫瘤細胞部位發出明亮熒光，隨著時間變化腫瘤逐漸增大（見圖3）。第5、8、11天腫瘤平均實測光子數為（53688222±25446363）、（2072443366±1029688415）、（5559915605±708457376） ph/s；根據小動物活體成像儀成像時生物發光光子數繪制曲線，其與腫瘤生長曲線的變化趨勢一致（見圖4）。

2.4 剝除腫瘤肉眼大體觀察 裸鼠在接種瘤細胞后第4～5天均能成瘤。腫瘤重量為（0.5020±0.0894） g；肉眼觀，在裸鼠局部皮下可見移植瘤為圓形或類圓形腫塊，剝除腫瘤可見腫瘤外周有纖維組織包繞，切面呈灰紅、灰白色，魚肉狀，質嫩較脆，易出血（見圖5）。

2.5 HE染色組織形態學觀察 HE染色光鏡下見腫瘤周圍由纖維組織包繞，腫瘤細胞排列成片狀或巢狀，可見腫瘤細胞浸潤血管現象，有不同程度的凝固性壞死；伴不同程度的炎性細胞浸潤，如淋巴細胞、漿細胞及嗜酸粒細胞等；瘤細胞大小不一，核型不規則，胞漿中等量，可見病理性核分裂象（見圖6A）；肝臟失去正常組織形態，伴隨腫瘤細胞浸潤（見圖6B）。

3 討論

圖3 裸鼠移植瘤模型IVIT成像Figure 3 IVIT imaging of nude mouse model of subcutaneous xenograft tumor

圖4 接種腫瘤細胞后不同時間點生物發光光子數曲線Figure 4 Curve of number of bioluminescent photons at different time points after inoculation of tumor cells

圖5 肉眼觀察3只裸鼠腫瘤形態變化Figure 5 Naked-eye observation of tumor morphological changes in three nude mice

圖6 裸鼠腫瘤組織和肝臟病理組織學表現（HE染色，×200）Figure 6 Tumor and liver histopathological findings of the nude mouse

近年來，IVIT在腫瘤發生發展、轉移及基因治療等領域備受研究者關注。與傳統腫瘤診療技術相比，IVIT具有傳統技術不可比擬的優勢，能夠無創、連續、動態監測腫瘤的生長變化，為研究腫瘤相關的動物實驗提供科學依據［13-14]。目前，建立人類裸鼠腫瘤移植瘤模型是現今生物醫學轉化研究的重要工具，通過模擬人體環境，借助活體生物發光成像系統可直觀、連續、敏感地對腫瘤進行動態可視化觀察，指導醫生制定最適診療方案［15-16]。鑒于腫瘤細胞本身無光學特性，因此，通過能發光且可檢測的生物源性熒光——Luc基因標記腫瘤細胞，使腫瘤細胞攜帶可發光的Luc基因，隨后將該類具備發光性能的細胞接種于裸鼠皮下，在裸鼠腹腔注射熒光素酶底物后，即可通過小動物活體成像儀中靈敏的CCD相機設備定量檢測體內所發射的光子數量并最終轉換為人類肉眼可見圖像，達到連續動態觀測腫瘤生長變化的目的。

本研究首先常規培養NK92-Luc細胞，在顯微鏡下，可見NK92-Luc細胞在培養基中呈懸浮、成簇狀生長，細胞形態為圓形、類圓形，生長情況較好。隨后，成功建立裸鼠皮下NK/T細胞淋巴瘤移植瘤模型。這與任苑蓉等［17]用于研究人大細胞肺癌而構建的L9981-Luc研究結果相一致。同時，測量第5天、8天、11天荷瘤裸鼠腫瘤體積，結果表明3只裸鼠腫瘤體積在前2 d增長不明顯，在第3～5天腫瘤體積增長明顯加快，在第6～8天腫瘤體積增長速度最快，這表明腫瘤細胞進入裸鼠皮下后可迅速擴增。在腫瘤細胞注射至裸鼠皮下第5天，通過小動物活體成像儀觀測到腫瘤部位較強的熒光信號，熒光信號越強反映腫瘤細胞數量越多，也代表腫瘤體積越大，結果顯示，腫瘤部位熒光信號強度隨天數增加而增強。根據小動物活體成像儀成像時生物發光光子數繪制的曲線，與腫瘤生長曲線變化趨勢一致，證明本研究使用無創技術，達到了連續示蹤裸鼠體內腫瘤變化的目的。這說明小動物活體成像儀可成功監測裸鼠皮下移植瘤模型的演進過程，可為腫瘤體內生長、轉移等研究提供無創、定量示蹤手段［18-19]。

綜上，本研究以NK92-Luc細胞、裸鼠皮下移植瘤模型為研究對象，成功構建NK/T細胞淋巴瘤，通過IVIT動態觀測并示蹤活體腫瘤，初步探索NK/T細胞淋巴瘤的診斷新方法，具有重要的科學價值和臨床意義。