頭穴叢刺干預對腦出血大鼠神經功能及腦組織含水量的影響?

邵文娜 邵佳凱 沈詩彥 崔 海△

（1.首都醫科大學，北京 100069；2.首都醫科大學附屬北京中醫醫院，北京 100010）

腦出血（ICH）是一種常見的腦卒中類型，其高致殘性、高死亡率及高發病率的特點已得到醫學界的廣泛認可［1］。腦出血在中醫學屬于“中風病”中的“出血性中風”。現代醫學對該病的治療方法不多，且療效并不理想，預后效果也不佳。近年來，關于針刺及電針治療ICH的研究大幅增加，但對于頭穴叢刺干預ICH的研究鮮有報道。本研究應用頭穴叢刺激治療ICH大鼠，并采用改良神經功能缺損嚴重程度評分及腦組織含水量的測定評價療效，初步探討其相應的機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠72只，體質量200～300 g，由首都醫科大學動物部提供［許可證號：SCXK（京）2016-0011］。分籠飼養于首都醫科大學動物房內，溫度（23±2）℃，相對濕度40%～70%，光照周期為12 h光照/12 h黑暗，自由獲取食物和水。

1.2 試劑與儀器 1）試劑：膠原蛋白酶Ⅶ（C0773）（美國Sigma公司，1.5 KU，1000～3000 CDU/mg）；二甲亞砜（DMSO）（D5879）（美國Sigma公司，100 mL，98%）；選擇性抑制劑鋅原卟啉（ZPP-IX抑制劑）（Zn625-9）（美國Frontier公司，25 mg，96%）；75%酒精溶液（山東利爾康醫療科技股份有限公司，500 mL，75%）；0.9%氯化鈉注射液（石家莊四藥有限公司，500 mL，90%）。2）儀器：-20℃/4℃冰箱［中國青島海爾股份有限公司，BCD-290W（專供）］；0.01 g天平（德國Sartorius公司，TE412-L）；腦立體定位儀（深圳RWD Life Science公司，C4F04-001）；電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司，101-0AB）；一次性無菌針灸針（云龍醫療器械公司，直徑0.25 mm，長度25 mm）。

1.3 分組及造模 72只大鼠隨機分為空白對照組、假手術組、模型組、頭穴叢刺組、ZPP-IX抑制劑組、ZPP-IX抑制劑+頭穴叢刺組，每組各12只，再分為1、3、7 d 3個亞組。采用Ⅶ膠原酶誘導制備大鼠腦出血模型［2-3］。在12 h禁食和4 h禁水后，用戊巴比妥鈉（300 mg/kg）通過腹腔給藥麻醉大鼠，待麻醉成功后將其備皮并固定在腦立體定位儀上，剪開頭皮，暴露前囟、冠狀縫和矢狀縫。在右側顱骨，于前囟后0.2 mm，右3 mm處，用鉆頭鉆一個1 mm的小孔，在大鼠尾狀核處用5 μL的微量注射器注入2 μL Ⅶ膠原酶（0.5 U/μL），深度5 mm，5 min內分次注射完畢后（0.2 μL/30 s），留針5 min，隨后緩慢取出微量注射器，縫合傷口。待大鼠術后蘇醒后根據Longa評分法［4］。0分：無神經缺陷；1分：未完全伸展左前爪；2分：向左旋轉；3分：倒向左邊；4分：沒有自發行走，意識水平低下，進行神經功能評分，評分≥1分可認為模型制備成功［4］。模型制備失敗及死亡的大鼠剔除實驗，按照隨機抽樣原則選取大鼠重新造模。空白對照組不接受任何處理，假手術組造模鉆孔后在尾狀核處注入2 μL 0.9%氯化鈉注射液，模型組造模鉆孔后在大鼠尾狀核注入2 μL膠原酶。

1.4 干預方式 頭穴叢刺組進行頭穴叢刺干預，取穴：根據《實驗動物穴位圖譜》［5］，取百會穴及百會左右兩側2 mm的四神聰穴，用一次性無菌針灸針進行針刺，留針30 min，每日1次，共7 d。ZPP-IX抑制劑組：造模術后30 min內腹腔注射ZPP-IX抑制劑（10 mg/mL）。ZPP-IX+頭穴叢刺組：針刺同頭穴叢刺組，ZPP-IX抑制劑用法用量同ZPP-IX抑制劑組。其余各組不進行針刺及藥物干預。

1.5 標本采集與檢測 每組隨機選取3只于術后1、3、7 d過量麻醉后于冰面上斷頭處死，取腦組織稱質量，各組1、3、7 d取腦組織后剩余的大鼠用于改良的神經功能缺損評分（mNSS）。用一次性無菌紗布稀釋表面多余水分與血漬后，放于天平稱質量，為濕質量；然后將腦組織放于60℃烘箱內烘48～96 h，反復稱質量直至質量不再變化，為干質量。腦含水量=（濕質量-干質量）/濕質量×100%。

1.6 神經行為學評分 測試由對實驗分組不知情的觀察者進行。mNSS測試包括：運動、感覺、平衡和反射測試［6］。1）運動測試：提起大鼠尾部，前肢屈曲記1分，后肢屈曲記1分，30 s內在垂直軸頭移動＞10°記1分；將大鼠放在地板上，正常行走0分，不能走直線記1分，向癱瘓側轉圈記2分，倒向癱瘓側記3分。2）感覺測試：放置試驗（視覺和觸覺測試）1分，本體感覺試驗（深感覺，按壓大鼠爪子到桌子邊緣刺激肢體肌肉）1分。3）平衡測試即平衡木試驗：姿勢穩定平衡0分，緊抓平衡木邊緣記1分，緊抱平衡木且一肢體從其上面掉下記2分，緊抱平衡木且兩肢體從其上面掉下或在其上面旋轉（＞60 s）記3分，嘗試在平衡木上保持平衡但摔下（＞40 s）記4分，嘗試在平衡木上保持平衡但摔下（＞20 s）記5分，從不嘗試平衡或抓住平衡木便落下（＜20 s）記6分。4）反射測試：耳郭反射（觸及耳道時搖頭）記1分，角膜反射（當用棉花觸及角膜時眨眼）記1分，驚嚇反射（對迅速敲擊木板發出短暫聲響的運動反應）記1分，癲癇發作，肌陣攣，肌張力障礙記1分［7］。mNSS神經功能缺損的程度從0～18評分（正常評分，0；最大評分，18）。標準設定如下：13～18分，嚴重傷害；7～12分，中度傷害；1～6分，輕傷；0分為正常，對傷害嚴重程度進行評分時，無法進行測試或缺乏測試反射可獲得1分［8］。得分越高，損傷越嚴重。

1.7 統計學處理 應用SPSS23.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，采用方差分析進行正態分布檢驗及配對樣本t檢驗進行組間差異比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能評分比較 見表1。空白對照組與假手術組的各亞組均無明顯的神經功能缺損，模型組、頭穴叢刺組、ZPP-IX抑制劑組和ZPP-IX抑制劑+頭穴叢刺組均在術后第1天評分開始升高，第3天評分達到最高值，第7天明顯下降，頭穴叢刺組在1、3、7 d的神經功能評分均低于頭穴叢刺組（P＜0.05或P＜0.01），ZPP-IX抑制劑+頭穴叢刺組在1、3、7 d的神經功能評分均低于ZPP-IX抑制劑組（P＜0.05或P＜0.01）。提示頭穴叢刺可以降低腦出血大鼠神經功能評分，改善腦出血大鼠的神經功能。

表1 頭穴叢刺干預對腦出血大鼠神經功能的影響（分，±s）

表1 頭穴叢刺干預對腦出血大鼠神經功能的影響（分，±s）

與模型組同時間點比較，?P＜0.05，?P＜0.01；與ZPP-IX組同時間點比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同

組別空白對照組假手術組模型組頭穴叢刺組ZPP-IX抑制劑組ZPP-IX頭穴叢刺組n 6 6 6 6 6 61 d 0.00±0.000.00±0.0012.00±2.909.50±2.26*12.50±2.959.00±1.26△3 d 0.00±0.000.00±0.0013.83±1.9411.83±2.23*14.00±1.6711.67±1.21△△7 d 0.00±0.000.00±0.004.00±0.632.67±0.82**4.33±0.522.83±0.75△△

2.2 各組大鼠腦含水量比較 見表2。空白對照組與假手術組的各亞組腦組織含水量無明顯差異，模型組、頭穴叢刺組、ZPP-IX抑制劑組和ZPP-IX抑制劑+頭穴叢刺組均在術后第1天開始增加，第7天明顯回降，與模型組比較，頭穴叢刺組的腦含水量下降（P＜0.01），與ZPP-IX抑制劑組比較，ZPP-IX抑制劑+頭穴叢刺組的腦含水量下降（P＜0.01）。提示頭穴叢刺可以降低腦出血大鼠腦組織含水量，對腦水腫起到抑制作用。

表2 頭穴叢刺干預對腦出血大鼠腦含水量的影響（%，±s）

表2 頭穴叢刺干預對腦出血大鼠腦含水量的影響（%，±s）

組別空白對照組假手術組模型組頭穴叢刺組ZPP-IX抑制劑組ZPP-IX頭穴叢刺組n 3 3 3 3 3 31 d 75.96±0.90**75.36±0.10**79.08±0.1476.98±0.28**79.42±0.3377.00±0.52△△3 d 76.03±1.1676.22±1.1680.02±0.0676.08±0.04**80.52±0.21**76.38±0.03△△7 d 74.60±0.54**74.16±0.14**78.39±0.4374.90±0.43**78.30±0.44**75.67±0.43△△

3 討論

腦出血是腦卒中的一種亞型，約占所有中風死亡的15%，約75%的幸存者患有嚴重的神經功能缺損［9-10］。在ICH后立即發生血腫周圍的腦水腫，并在幾天后出現峰值，如果不及時處理，嚴重者可破壞血腦屏障、減少腦血流量甚至引起腦萎縮［11-12］。針灸已被廣泛用作中風患者的替代治療方法，針灸有多種生物反應，包括循環和生化作用等，能在一定程度上緩解中風患者的痛苦［13］。頭穴叢刺通過對前頭部、后頭部、側頭部腧穴的主治特點和作用規律的研究和總結，并借鑒超聲波治療原理提出了“針場”假說，在此基礎上基于傳統針灸療法治療中風病的不足和頭部腧穴具有相互協同、綜合調節的作用，結合臨床實踐和大腦解剖生理功能而提出［14-15］。頭穴叢刺療法治療ICH效果顯著，此治療作用得到中醫針灸界的公認［16］。有學者開展了頭穴針刺治療急性腦出血研究，表明腦出血急性期完全可以應用頭穴針刺治療而且療效顯著，應用頭穴針刺干預ICH越早者療效更加顯著，其恢復時間越快，后期恢復水平也相對較高，尤其即刻效應和近期療效的效果更加明顯［17-18］。我們前期的臨床研究發現頭穴叢刺法操作簡單、安全、療效好，但其治療機制至今未明。

本研究結果顯示ICH后腦組織含水量及神經功能缺損評分在第3天達到最高值，而頭穴叢刺組及ZPPIX抑制劑+頭穴叢刺組有效降低了ICH大鼠的腦含水量及神經功能評分，因此在ICH早期進行頭穴叢刺治療，可有效降低ICH后的腦組織含水量，增加腦血流量，保護腦組織，使神經功能得以改善。除此之外，我們認為腦出血的作用機制可能與Nrf2通路下游的血紅素氧合酶-1（HO-1）、醌氧化還原酶1（NQO1）有關，頭穴叢刺在急性期進行干預可能是通過下調Nrf2、HO-1、NQO1的含量而降低腦損傷。ZPP-IX抑制劑可以抑制HO-1的表達，從而增加腦組織的損傷，筆者設立ZPP-IX抑制劑組與模型組比較，ZPP-IX抑制劑組的神經行為學評分增高，腦含水量升高，認為可能與Nrf2通路下游的HO-1的表達被抑制有關；ZPP-IX抑制劑組與ZPP-IX抑制劑+頭穴叢刺組比較，ZPP-IX抑制劑+頭穴叢刺組的神經行為學評分降低及腦含水量下降的程度更顯著，說明頭穴叢刺可以對腦損傷起到保護作用。

綜上所述，頭穴叢刺作為一種獨特的針灸方式，可以在腦出血早期起到減少腦組織含水量、降低神經功能評分的作用，對腦組織起到保護作用，但具體的作用機制還有待我們下一步實驗研究發現。