針刺對膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠NGF、SP的影響?

繆輝宇 曲崇正 黃宏興

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510407）

針刺療法在治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（KOA），尤其是在鎮(zhèn)痛方面的確切療效已被臨床實(shí)踐所驗(yàn)證。以往的研究較多局限于針刺療法對關(guān)節(jié)軟骨的病變及炎性因子的刺激上，但對針刺鎮(zhèn)痛的臨床研究并不多見。因此，本實(shí)驗(yàn)通過建立KOA動物模型，以大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜為研究對象，引入神經(jīng)生長因子（NGF）和P物質(zhì)（SP），采用免疫組化技術(shù)研究針刺對NGF、SP的影響，為針刺治療KOA的鎮(zhèn)痛機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 成年SD大鼠75只，體質(zhì)量220～280 g，雌性40只，雄性35只，來源于廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。所有大鼠均飼養(yǎng)于恒溫恒濕的清潔環(huán)境中，環(huán)境溫度為（25±1）℃，濕度70%，每天12 h光照/12 h黑暗，所選大鼠在實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)并適應(yīng)飼養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)期間動物的處理符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定。

1.2 試藥與儀器 1）試藥：木瓜蛋白酶（廣西南寧杰沃利生物制品有限公司生產(chǎn)），配制成0.1 mL 4%木瓜蛋白酶生理鹽水。即用型兔抗人NGF及SP、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程公司生產(chǎn)）。西樂葆（輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字J20140072，0.2 g）。戊巴比妥鈉（成都華夏公司生產(chǎn)，批號922L0314，50 mg）。2）儀器：撳針（北京中研太和醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)；長度為5 mm、直徑為0.28 mm，蘇食藥監(jiān)械生產(chǎn)許20010168號）。

1.3 分組與造模 采用隨機(jī)數(shù)字表將大鼠分為5組，各15只，其中4組進(jìn)行木瓜蛋白酶造模，另1組不做任何干預(yù)作為對照的正常組，造模方法為：將大鼠用戊巴比妥鈉（30 mg/kg）進(jìn)行靜脈注射麻醉，對左側(cè)膝關(guān)節(jié)皮膚進(jìn)行常規(guī)消毒，然后在麻醉起效后將0.1 mL 4%木瓜蛋白酶生理鹽水經(jīng)大鼠的髕上韌帶兩側(cè)注入至左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，每3日注射1次，連續(xù)注射3次完成造模。造模術(shù)后持續(xù)1周肌注青霉素5萬U/d以預(yù)防感染。造模大鼠分為造模組、西樂葆組、針刺穴位組、針刺非穴組。

1.4 干預(yù)方法 動物常規(guī)飼養(yǎng)，干預(yù)方法在木瓜蛋白酶末次注入后2周后進(jìn)行。1）造模組和正常組：正常飼養(yǎng)不做其他處理。2）針刺穴位組：取穴參照華興邦等制定的《大鼠穴位圖譜的研制》［1］中大鼠穴位定位，取左側(cè)膝眼、血海、陽陵泉穴。操作方法：常規(guī)消毒局部皮膚，左手固定大鼠左膝部，右手用鑷子夾住針柄，針尖在穴位垂直穿刺，然后用膠帶固定針柄30 min，每日1次。所有大鼠在7 d后都被處死。處死后取下滑膜。3）針刺非穴組：選擇穴位組選擇的3個穴位旁開2 cm的非穴位進(jìn)行針灸，其余操作均同穴位組。4）西樂葆組：按24 mg/kg溶于2 mL純凈水中灌胃，每日1次，連續(xù)7 d后處死全部大鼠。

1.5 標(biāo)本采集及檢測 造模組和正常組在造模結(jié)束兩周后以空氣栓塞法處死造模組和正常組的大鼠，無菌條件下取大鼠左膝內(nèi)下方滑膜，0.9%氯化鈉注射液沖洗后用10%的甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，備用。針刺穴位組、針刺非穴位組、西樂葆組均在干預(yù)7 d后處死大鼠并取大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜。具體處死方法和取材同造模組及正常組。1）免疫組化染色：將石蠟包埋好的滑膜標(biāo)本切片，厚約4 μm，分別進(jìn)行NGF和SP免疫組化染色。常規(guī)脫蠟至水后，于0.3%H2O2的甲醇內(nèi)進(jìn)行室溫孵育20 min，再在92℃～98℃的醫(yī)用微波下抗原修復(fù)10 min。一抗：正常山羊血清密封劑在室溫下孵育20 min，用適當(dāng)稀釋的抗NGF或SP滴注（一部分切片滴NGF抗體，剩下一部分滴SP抗體），濕盒內(nèi)4℃恒溫過夜。二抗：PBS溶液沖洗3次，每次間隔5 min，生物素化二抗，滴加SABC試劑后37℃孵育20 min。DAB顯色液顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。2）免疫組化觀察及等級標(biāo)準(zhǔn)：用顯微鏡觀察各組陽性細(xì)胞形態(tài)及分布，進(jìn)行真彩色圖像分析（德國Koutron公司IBAS真彩色圖像分析儀）。根據(jù)陽性血管分布占比分為3級：＜40%為-，40%～70%為+，＞70%為++。每張病理切片選擇3個視野進(jìn)行分析，分別記錄陽性表達(dá)的數(shù)量，陽性表達(dá)數(shù)取切片3個觀察視野的平均值。根據(jù)圖像分析系統(tǒng)，算出陽性面積和陽性區(qū)域平均灰度值，折算成陽性單位值（PU），并按文獻(xiàn)［2］方法PU=［（區(qū)域陽性產(chǎn)物灰度值-區(qū)域灰度值）/（區(qū)域背景面積密度×最大灰度分級）］×100%。PU大小與反應(yīng)強(qiáng)度成正比。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s），組間比較用t檢驗(yàn)，計數(shù)資料用（%），組間比較用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組滑膜切片NGF表達(dá) 見圖1。NGF在血管周圍表達(dá)，為胞漿著色，棕黃色，呈半環(huán)形或環(huán)形，顆粒狀。陽性細(xì)胞染色＞血管周長的40%即代表陽性結(jié)果。每張病理切片選擇3個視野進(jìn)行分析，分別記錄陽性表達(dá)的數(shù)量，陽性表達(dá)數(shù)取切片3個觀察視野的平均值。正常組見少量NGF陽性細(xì)胞；造模組較正常組明顯增多；西樂葆組、針刺非穴組與針刺穴位組陽性細(xì)胞數(shù)較造模組降低；但西樂葆組、針刺非穴組降低幅度更大。

圖1 滑膜切片NGF表達(dá)（免疫組化法，400倍）

2.2 各組滑膜切片SP表達(dá) 見圖2。SP位于血管壁，呈棕黃色顆粒狀。陽性細(xì)胞染色＞血管周長的40%即代表陽性結(jié)果。每張切片同樣選擇3個視野進(jìn)行分析，陽性表達(dá)數(shù)取3個記錄的均值。正常組見少量SP陽性細(xì)胞；造模組較正常組明顯增多；西樂葆組、針刺非穴組與針刺穴位組陽性細(xì)胞數(shù)較造模組降低；但西樂葆組、針刺非穴組降低幅度更大。

圖2 滑膜切片SP表達(dá)（免疫組化法，400倍）

2.3 各組大鼠NGF陰性、陽性、強(qiáng)陽性表達(dá)情況 見表1。針刺穴位組NGF總陽性率為13.33%，明顯低于非針刺穴位組60.00%（P＜0.01）；而西樂葆組與針刺穴位組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠NGF陰性、陽性、強(qiáng)陽性表達(dá)情況（n）

2.4 各組大鼠SP陰性、陽性、強(qiáng)陽性表達(dá)情況 見表2。針刺穴位組SP總陽性率為6.67%，顯著低于針刺非穴組的SP總陽性率53.33%（P＜0.01）；但針刺穴位組與西樂葆組比較差異不顯著（P＞0.05）。

表2 各組大鼠SP陰性、陽性、強(qiáng)陽性表達(dá)情況（n）

2.5 各組大鼠NGF、SP水平比較 見表3。較之造模組大鼠，針刺穴位組、西樂葆組大鼠的NGF、SP陽性表達(dá)率明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；且針刺穴位組的NGF、SP陽性表達(dá)低于針刺非穴組（P＜0.05）；但針刺穴位組與西樂葆組比較NGF、SP陽性表達(dá)并無明顯差異（P＞0.05）。

表3 各組大鼠滑膜內(nèi)NGF、SP表達(dá)比較（Pu，±s）

表3 各組大鼠滑膜內(nèi)NGF、SP表達(dá)比較（Pu，±s）

組別正常組造模組西樂葆組針刺穴位組針刺非穴組n 1515151515 NGF-0.41±2.3127.39±20.771）2.17±2.861.81±2.742）11.23±10.21 SP-0.33±2.3729.29±13.16*2.61±2.18*1.75±1.99*△10.53±9.88

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)學(xué)“骨痹”范疇，多因人體正氣虧虛，風(fēng)寒濕外邪侵襲，痹阻氣血，流注經(jīng)脈所致［3］。65歲以上老年人KOA發(fā)病率高達(dá)85%［4-5］。現(xiàn)有西醫(yī)治療多以非甾體消炎藥緩解癥狀為主，但長期使用后胃腸道毒副作用明顯，常使患者不能耐受而終止治療。目前臨床上已越來越多地使用針刺來達(dá)到鎮(zhèn)痛的效果，且針刺副作用小，患者能夠長期治療。

NGF是神經(jīng)營養(yǎng)因子中的一員，主要起著維持神經(jīng)元存活，調(diào)節(jié)周圍和中樞神經(jīng)元發(fā)育的作用，是人體中不可缺少的因子。有研究報道，神經(jīng)生長因子主要是根據(jù)低親和力p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體（p75ntr）和高親和力酪氨酸激酶A（trka）調(diào)控疼痛，在疼痛的發(fā)生和發(fā)展中起著生物學(xué)作用，參與疼痛發(fā)生、發(fā)展的各個環(huán)節(jié)［6］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NGF水平升高與疼痛呈正相關(guān)［7］。而針刺鎮(zhèn)痛與NGF相關(guān)研究鮮見發(fā)表，僅有熊鍵等發(fā)現(xiàn)電針可以通過抑制NGF的表達(dá)達(dá)到鎮(zhèn)痛的目的［8］。

SP是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫和內(nèi)分泌的重要因素，可被免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)識別［9-10］。在機(jī)體不同系統(tǒng)具有不同的生理學(xué)效應(yīng)，對針灸與P物質(zhì)的研究主要在鎮(zhèn)痛作用方面。徐小丹［11］研究顯示電針可抑制SP的釋放，從而產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛作用。郭奎奎等發(fā)現(xiàn)局部和遠(yuǎn)道取穴在抑制SP釋放及鎮(zhèn)痛方面無顯著性差異［12］。劉苗苗等發(fā)現(xiàn)針刺聯(lián)合中藥離子可緩解腰椎間盤突出癥引起的疼痛［13］。

針刺療法在治療KOA方面特別是鎮(zhèn)痛效果的確切療效已被臨床實(shí)踐所驗(yàn)證。以往的研究較多局限于關(guān)節(jié)軟骨的病變及炎性因子的刺激上。本課題通過建立KOA大鼠模型，以大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜為研究對象，引入NGF和SP細(xì)胞因子，采用免疫組化技術(shù)研究針刺對NGF、SP的影響，為針刺治療KOA的鎮(zhèn)痛機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，針刺穴位組與西樂葆組NGF、SP含量均顯著低于造模組，且兩者對比無顯著性差異（P＞0.05），兩組在緩解疼痛方面療效相當(dāng)，但針灸更加安全可靠，在今后KOA患者的長期治療中更可取。

目前臨床上治療KOA主要是口服西樂葆，由于老年人患KOA較多，且易合并心血管、胃腸道等其他疾病，但西樂葆臨床適用性有限。且既往有臨床研究表明，西樂葆治療老年KOA易引起惡心、脹氣、便秘等不良反應(yīng)。而針灸療法可疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)和陰陽、扶正去邪，具有許多優(yōu)點(diǎn)：1）適應(yīng)證廣，可用于多科疾病；2）操作方法簡便易行；3）醫(yī)療費(fèi)用經(jīng)濟(jì)；4）副作用較小。陽陵泉、血海、膝眼是臨床上治療KOA常用穴位［14-15］。針刺上述穴位可降低疼痛中樞的敏感性，改善關(guān)節(jié)疼痛癥狀以及局部組織微循環(huán)和全身血液循環(huán)，加速關(guān)節(jié)積液和血腫的吸收，緩解關(guān)節(jié)腫脹癥狀，增強(qiáng)機(jī)體對外界刺激的承受能力［16］。

綜上所述，針刺能有效抑制KOA大鼠滑膜內(nèi)NGF、SP的表達(dá)，這可能是針刺治療KOA有效的機(jī)制之一，但由于本研究數(shù)據(jù)較小，其具體作用機(jī)制以及滑膜是否有修復(fù)作用，還有待進(jìn)一步研究。