中藥逐水飲對小鼠Lewis肺癌胸腔積液模型積液生成及Th17免疫平衡的影響?

劉曉芳 金昌鳳 魏一強 趙 靜 孫素芹 高 磊 李義君

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150036；2.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江哈爾濱 150000）

惡性胸腔積液（MPE）約占全部胸腔積液的38%～53%，其中約40%MPE是由肺癌、淋巴癌、乳腺癌等惡性腫瘤胸膜轉移引起，是腫瘤擴散或病情進展至晚期的常見并發癥之一，臨床MPE的發生往往預示預后不良［1-2］。大量胸腔積液可造成患者胸悶、胸痛、呼吸困難、氣促等癥狀，嚴重者可危及生命，因此積極有效地控制MPE對改善腫瘤患者臨床癥狀，提高生存質量，延長生存期十分重要。目前，MPE治療方法較多，但采用手術等方法會引起晚期及老年患者不能耐受，且短期內復發率仍然很高，同時化療藥物毒副作用也較大［3-4］。中醫藥可通過作用于MPE形成的多個環節抑制MPE形成，具有一定安全性和治療療效，是近年來臨床治療惡性腫瘤并發癥的手段之一［5］。中藥逐水飲由黨參、黃芪、白術、葶藶子等藥物組成，具有瀉肺利水、消除積液、益氣健脾等作用。本研究體外建立小鼠Lewis肺癌胸腔積液模型，觀察中藥逐水飲對小鼠MPE生成及Th17細胞免疫平衡的影響，探討其治療MPE的可能作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性C57BL/6小鼠，70只，SPF級，12周齡，體質量15～25 g，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SYXK（黑）20160013。

1.2 試藥與儀器 1）試藥：中藥逐水飲，組成：黃芪20 g，人參15 g，葶藶子20 g，瓜蔞皮20 g，大棗15 g，桑白皮15 g，百部15 g，苦參20 g，莪術15 g，白花蛇舌草20 g，夏枯草10 g，甘草15 g。水煎煮2次，濃縮配制為生藥含量1g/mL藥液。小鼠Lewis肺癌瘤株，上海研生實業有限公司提供。胎牛血清，HyClone公司，批號20170619；生藥含量1 g/mL DMEM培養基，HyClone公司，批號20170619；RPMI1640培養基，上海玉博生物科技有限公司，批號20170725；臺盼藍染色液，北京索萊寶科技有限公司，貨號C0040；順鉑注射液，規格：每支10 mg，齊魯制藥有限公司，批號20160309；FIcoll分離液，北京索萊寶科技有限公司，批號20170309；枸櫞酸鈉，南京化學試劑有限公司，批號080560059；佛波酯，北京索萊寶科技有限公司，貨號P6741；離子霉素，美國Sigma公司，批號I-0634；FITC標記的CD4抗體（批號20170503）、PE標記的RORγτ抗體（T17）（批號20170416）、Alexa647標記的Foxp3抗體（Treg）（批號20170328）購于北京奧維亞生物技術有限公司；白細胞介素17（IL-17）（批號ab83708）、白細胞介素23（IL-23）（批號ab23305）、轉化生長因子β1（TGF-β1）（批號ab86349）試劑盒購于Abcam公司。2）儀器：HH-6數顯恒溫水浴鍋，上海析達儀器有限公司；RCO3000TVBA CO2培養箱，REVCO公司；DYS-107三目生物顯微鏡，上海點應光學儀器有限公司；MS-TS精密天平，梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；FACSCalibur流式細胞儀，BD公司。

1.3 細胞傳代及Lewis肺癌單細胞懸液制備 取小鼠Lewis肺癌瘤株，快速放入37℃水浴鍋中復溫，轉移至新的無菌離心管中，輕輕吸打使細胞均勻分散，800 r/min離心5 min，棄上清，加入適量含有10%胎牛血清的新鮮DMEM培養基，重懸，制成細胞懸液。取細胞懸液加入250 mL培養瓶中，放入培養箱培養，待細胞80%～90%融合時進行傳代，3～4 d傳代1次。取第3代細胞，接種于小鼠腋背部皮下。取接種10～14 d的小鼠，處死，剝離腫瘤組織，取生長良好的瘤組織，用生理鹽水反復沖洗后，用無菌玻璃杵子將瘤塊碾碎成單細胞懸液，經150目篩網過濾后，將細胞懸液轉移至無菌離心管中，1500 r/min離心5 min，棄上清，使用0.9%氯化鈉溶液洗滌2次。加入0.9%氯化鈉溶液重懸細胞，臺盼藍染色檢測活性細胞＞90%，調整細胞濃度為2×106個/mL。

1.4 動物分組及小鼠Lewis肺癌胸腔積液模型建立70只小鼠去除胸前毛發，75%乙醇常規消毒，隨機選取56只小鼠經胸前皮下短時間內注射0.2 mL上述細胞懸液建立Lewis肺癌胸腔積液模型，給藥1次［6］。造模成功后，隨機分為模型組、逐水飲組、順鉑組、逐水飲+順鉑組，每組14只。另取14只小鼠皮下短時間內注射0.2 mL 0.9%氯化鈉溶液作為正常對照，給藥1次。

1.5 干預方法 正常對照組正常喂養，不做任何處理。Lewis肺癌胸腔積液模型小鼠建模后第3日起開始給藥。模型組正常喂養，不給予任何藥物。逐水飲組：參考范一平等方法［7］，將27 g/（kg·d）生藥藥液調整至0.2 mL給予小鼠灌胃，每日1次。順鉑組：將順鉑注射液用9 L 0.9%氯化鈉注射液稀釋后，以6 mg/（kg·d）胸腔灌注，隔3日1次。逐水飲+順鉑組：27 g/（kg·d）生藥藥液，調整至0.2 mL給予小鼠灌胃，每日1次，同時給予胸腔灌注順鉑6 mg/（kg·d），隔3日1次。各組連續給藥10 d。

1.6 樣本采集 于建模后第14日行胸部CT檢查，觀察胸腔積液生成情況。給藥結束后（即建模后第14日），每組取8只小鼠處死。眼球取血，一部分1 mL血樣，經2000 r/min離心后收集血清-80℃保存；另一部分1 mL血樣，以體積比1∶1加入PBS溶液稀釋，使用FIcoll分離液分離單個核細胞。同時收集MPE，測量MPE體積。取適量MPE，離心后，棄上清，加入PBS溶液重懸，使用FIcoll分離液分離單個核細胞；另取適量MPE，以體積比9∶1加入3.8%枸櫞酸鈉抗凝，離心取上清保存。每組剩余6只小鼠用于觀察生存率。

1.7 觀察項目 1）胸壁轉移瘤計數、轉移瘤質量：由兩位經驗豐富的醫師，在解剖顯微鏡下計數前、側、后胸壁轉移瘤個數，然后剝離胸壁轉移瘤，稱質量。2）流式細胞術檢測MPE及外周血中Th17、Treg細胞百分比：離心收集MPE單個核細胞和外周血單個核細胞，加入RPMI1640培養基重懸，調整細胞濃度為2×106個/mL，分別加入2 μL佛波酯和伊屋諾霉素混合液、1 μL離子霉素混勻，置于37℃，5%CO2培養箱中培養4 h。取200 μL細胞懸液，加入FITC標記的CD4抗體、PE標記的RORγτ抗體（Th17）、Alexa647標記的Foxp3抗體（Treg）及其相應同型抗體，4℃避光染色30 min。使用含2%胎牛血清的PBS溶液洗滌1次，然后加入200 μL PBS溶液重懸，并轉移至流式檢測管。使用FACSCalibur流式細胞儀（BD公司）檢測各種熒光素強度，Flow-Jo7.6.5軟件分析Th17細胞和Treg細胞占CD4+T細胞的百分比。3）MPE及外周血中IL-17、IL-23、TGF-β1因子水平：取血清和MPE上清，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血樣和MPE中IL-17、IL-23、TGF-β1表達水平。操作步驟嚴格參照試劑盒說明書進行。

1.8 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析檢驗，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，計數資料用百分數表示，行χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組胸腔解剖及CT檢查結果 見圖1，圖2。建模后第14日，各組小鼠行胸部CT檢查，結果正常對照組小鼠肺野清晰，胸膜光整，而模型組可見大量胸腔積液生成，順鉑組、逐水飲組和逐水飲+順鉑組胸腔積液減少（見圖1）。處死小鼠，剖開胸骨，暴露胸壁，正常對照組小鼠可觀察到雙肺色白，胸壁光滑，而模型組小鼠明顯可見血性胸腔積液（見圖2，白色箭頭所示為血性胸腔積液）。

圖1 各組小鼠胸部CT掃描圖

圖2 小鼠胸腔解剖圖

2.2 各組小鼠MPE體積、胸壁轉移瘤數、轉移瘤質量及生存期比較 見表1。與模型組比較，逐水飲組、順鉑組和逐水飲+順鉑組小鼠MPE體積減小（P＜0.05），胸壁轉移瘤數目減少（P＜0.05），轉移瘤質量減輕（P＜0.05），生存期延長（P＜0.05）；逐水飲組和順鉑組小鼠MPE體積、胸壁轉移瘤數目、轉移瘤質量和生存期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與逐水飲組和順鉑組比較，逐水飲+順鉑組小鼠MPE體積、胸壁轉移瘤數目、轉移瘤質量和生存期變化更加明顯（P＜0.05）。

表1 各組小鼠MPE體積、胸壁轉移瘤數、轉移瘤質量及生存期比較（±s）

表1 各組小鼠MPE體積、胸壁轉移瘤數、轉移瘤質量及生存期比較（±s）

與模型組比較，?P＜0.05；與逐水飲組比較，△P＜0.05；與順鉑組比較，▲P＜0.05

組別模型組逐水飲組順鉑組逐水飲+順鉑組n 8 8 8 8 MPE體積（μL）683.95±57.52314.67±41.17*346.82±48.39*265.83±30.42*△▲胸壁轉移瘤數（個）8.91±0.766.24±0.58*5.66±0.61*4.17±0.38*△▲轉移瘤質量（mg）778.65±82.34513.71±62.79*446.91±71.24*311.24±47.28*△▲生存期（d）18.27±2.1921.22±1.94*21.06±2.03*23.59±1.37*△▲

2.3 各組MPE及外周血中Th17、Treg細胞百分比比較 見圖3～圖4，表2。與模型組比較，逐水飲組、順鉑組和逐水飲+順鉑組小鼠MPE和外周血中Th17細胞百分比升高（P＜0.05），MPE中Treg細胞百分比降低（P＜0.05）；逐水飲組和逐水飲+順鉑組小鼠MPE和外周血中Th17細胞百分比高于順鉑組（P＜0.05），Treg細胞百分比低于順鉑組（P＜0.05）；逐水飲+順鉑組小鼠MPE和外周血中Th17、Treg細胞百分比與逐水飲組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；各組小鼠MPE中Th17、Treg細胞百分比均高于其外周血中Th17、Treg細胞百分比（P＜0.05）。

圖3 各組小鼠MPE中Th17、Treg細胞比例流式圖

圖4 各組小鼠外周血中Th17、Treg細胞比例流式圖

表2 各組小鼠MPE及外周血中Th17、Treg細胞百分比比較（±s）

表2 各組小鼠MPE及外周血中Th17、Treg細胞百分比比較（±s）

與正常對照組比較，?P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與順鉑組比較，#P＜0.05；與本組外周血比較，▲P＜0.05。下同。

組別正常對照組模型組逐水飲組順鉑組逐水飲+順鉑組n 8 8 8 8 8 Th17 MPE—0.72±0.11▲1.24±0.26△#▲0.88±0.15△▲1.37±0.19△#▲外周血0.97±0.150.51±0.09*0.75±0.17△#0.65±0.11△0.86±0.20△#Treg MPE—14.01±3.147.12±2.05△#▲10.52±2.33△▲6.83±1.74△#▲外周血1.51±0.392.87±0.93*1.74±0.52△#2.58±0.71△1.66±0.47△#

2.4 各組MPE及外周血中IL-17、IL-23、TGF-β1因子表達水平比較 見表3。與正常對照組比較，模型組外周血中IL-17、IL-23水平降低（P＜0.05），TGF-β1水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，逐水飲組、順鉑組和逐水飲+順鉑組MPE和外周血中IL-17、IL-23水平升高（P＜0.05），TGF-β1水平降低（P＜0.05）；逐水飲組和逐水飲+順鉑組MPE和外周血中IL-17、IL-23水平高于順鉑組（P＜0.05），TGF-β1水平低于順鉑組（P＜0.05）；逐水飲組和逐水飲+順鉑組MPE和外周血中IL-17、IL-23、TGF-β1水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組小鼠MPE及外周血中IL-17、IL-23、TGF-β1因子表達水平比較（pg/mL，±s）

表3 各組小鼠MPE及外周血中IL-17、IL-23、TGF-β1因子表達水平比較（pg/mL，±s）

組別正常對照組模型組逐水飲組順鉑組逐水飲+順鉑組n 8 8 8 8 8 IL-17 MPE—18.53±2.5727.64±1.85△#23.37±2.14△28.69±1.91△#外周血23.91±2.1214.17±1.76*20.52±2.01△#17.43±1.58△21.72±1.83△#IL-23 MPE—11.54±2.6219.38±2.15△#16.57±1.73△20.11±2.05△#外周血16.53±1.948.39±1.44*13.52±1.86△#10.75±1.51△14.18±2.11△#TGF-β1 MPE—36.38±2.1912.75±1.96△#15.23±2.05△11.18±1.54△#外周血8.44±1.1530.42±2.51*10.33±1.62△#12.54±1.71△9.88±1.47△#

3 討 論

MPE為胸膜直接受累或肺癌、乳腺癌、淋巴瘤、消化系統惡性腫瘤等轉移至胸膜而引起胸膜腔液生成過快和（或）吸收減慢，導致液體積聚于胸膜腔［8］。約有5%～10%的MPE找不到原發腫瘤灶，一旦出現則預后不良，中位生存期僅為4個月［9-10］。中醫藥治療MPE，可通過趨化免疫炎性細胞、調節整體免疫功能、抑制化學性胸膜炎形成等多種途徑發揮抗腫瘤、抑制MPE形成，療效確切、作用溫和、毒副作用小，為腫瘤晚期及年老體弱患者的MPE治療提供了更多選擇［11］。

中醫學認為，MPE歸屬“懸飲”“支飲”范疇，津液失布，邪流胸脅，阻滯三焦，水飲積結，發為胸腔積液，以行氣利水、化瘀散結兼顧護正氣為主要療法［12］。本研究結果顯示，與模型組比較，逐水飲組、順鉑組和逐水飲+順鉑組小鼠MPE體積、胸壁轉移瘤數目減少，轉移瘤質量減輕，生存期延長，說明逐水飲和順鉑對MPE和腫瘤生長均具有一定抑制作用。逐水飲+順鉑組小鼠MPE體積、胸壁轉移瘤數目、轉移瘤質量和生存期與逐水飲組和順鉑組比較有明顯差異，提示逐水飲和順鉑聯用對腫瘤和MPE的抑制作用更加明顯。化療藥物能直接殺死或抑制腫瘤細胞增殖，但副作用明顯，部分患者耐受性較差，結合中藥逐水飲扶正祛邪，可減輕其毒副作用，改善患者耐受性，促進胸腔積液消退［13-14］。研究也證實中藥口服湯劑（如宣肺逐飲方、溫肺化飲方、葶藶甘遂逐水飲等）聯合順鉑胸腔灌注治療肺癌MPE的療效較單用順鉑更佳［15］。

MPE的產生、發展與其微環境密切相關，其中免疫細胞在MPE微環境中起重要作用，機體細胞免疫主要由CD4+輔助性T細胞和CD8+細胞毒T細胞介導，已有研究表明MPE中Th17/Treg細胞失衡提示預后不良［16-18］。本研究觀察各組小鼠MPE和外周血Th17細胞、Treg細胞水平，結果各組小鼠MPE中Th17、Treg細胞百分比均高于其外周血。與模型組比較，逐水飲組、順鉑組和逐水飲+順鉑組小鼠MPE和外周血中Th17細胞百分比升高，逐水飲組和逐水飲+順鉑組小鼠MPE和外周血中Treg細胞百分比降低。說明模型組小鼠MPE的微環境中Treg細胞較Th17細胞占優勢，可能因為小鼠直接胸腔接種，腫瘤細胞生長過快，免疫功能受到明顯抑制，Treg細胞升高較Th17細胞更加明顯，使Th17/Treg平衡偏向Treg細胞，而逐水飲可逆轉Th17/Treg細胞失衡狀態。TGF-β是決定初始CD4+T細胞向Th17細胞或Treg細胞分化的關鍵細胞因子［19］。本研究觀結果顯示，與模型組比較，逐水飲組、順鉑組和逐水飲+順鉑組MPE和外周血中Th17細胞相關細胞因子IL-17、IL-23水平升高，Treg相關細胞因子TGF-β1水平降低。說明逐水飲可抑制TGF-β1分泌，促進Th17細胞分化及IL-17、IL-23表達，從而促進腫瘤免疫反應，消除胸腔積液。

綜上所述，中藥逐水飲具有一定抑制小鼠胸腔積液的作用，且與化療藥物聯合應用時作用更加明顯。小鼠MPE微環境中Th17細胞失衡，逐水飲能夠促進Th17細胞分化及相關細胞因子表達，糾正微環境中Th17細胞失衡，減輕MPE微環境免疫抑制狀態，增強對腫瘤的免疫作用，發揮治療MPE作用。