積雪草苷調控GRP78/PERK/CHOP通路對急性心肌梗死大鼠的心肌保護作用研究?

楊 勇 殷紅珍 胡云飛

（1.安徽省滁州市第一人民醫院，安徽 滁州 239000；2.皖南醫學院弋磯山醫院，安徽 蕪湖241000；3.皖南醫學院，安徽 蕪湖 241000）

急性心肌梗死（AMI）是冠狀動脈急性狹窄或者閉塞，引起供血驟然減少或者終止，心肌嚴重缺血或壞死的急性病證，AMI具有發病急、致殘率、死亡率高等特征［1］。凋亡是引起心肌細胞死亡的主要形式。近年來研究證實，內質網應激是除了線粒體和死亡受體通路外的另一細胞凋亡通路［2］。細胞在缺氧缺血等多種因素下會引起細胞內未折疊或者錯誤折疊的蛋白集聚，激活內質網特異性分子伴侶葡萄糖調節蛋白78（GRP78），進而啟動內質網應激（ERS）反應，促使未折疊或者錯誤折疊的蛋白恢復正確構象，對細胞發揮保護作用，但應激時間過長，則會啟動ERS凋亡信號通路GRP78/蛋白激酶R樣內質網激酶（PERK）/轉錄因子C、EBP同源蛋白（CHOP），誘導細胞凋亡［3］。積雪草苷（AC）是中草藥積雪草的提取物。藥理研究表明，AC具有抗氧化、保護缺氧心肌細胞、保護血管內皮細胞的作用［4］。AC可顯著改善心肌梗死大鼠的膠原異常表達和心肌纖維化作用［5］。目前關于AC對急性心肌梗死大鼠內質網通路的研究較少，本研究通過制備急性心肌梗死大鼠模型，探究AC基于GRP78/PERK/CHOP通路對大鼠的心肌保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF8周齡級SD大鼠108只，體質量230～260 g，由鄭州大學實驗動物中心提供，合格證號為SYXK（豫）2018-0002；實驗動物均按照動物飼養規則由專人飼喂，室內溫度25℃，濕度60%，通風良好。

1.2 試藥與儀器 1）試藥：積雪草苷片（AC）（上海醫藥研究工業研究院，國藥準字Z200541446），牛磺酸（Tau）（美國Sigma公司），Bax、Caspase-12、Caspase-3、Bcl-2單抗（美國CST公司），GRP78單抗（美國Sigma aldrich公司）、PERK、CHOP單抗（英國Abcam生物公司），羊抗鼠IgG二抗（Santa Cruz公司），2，3，5-苯氯化四氮唑（TTC）（美國Amresco公司），蘇木素、伊紅染液（美國Sigma公司），Trizol、RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒（invitrogen公司），BCA試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）。2）儀器：1659001蛋白電泳儀（美國Bio-Rad公司）；GIS-500凝膠成像儀（Miulab公司），CFX96 PCR儀（美國BioRad公司），DW-2000小動物呼吸機（上海嘉鵬科技有限公司），3K15低溫離心機（美國Sigma公司），SpectraMax M5酶標儀（美國molecular devices公司）。

1.3 模型制備 大鼠適應性飼喂1周后，參考文獻［6］制備心梗模型，禁食12 h，10%水合氯醛腹腔麻醉，仰臥位固定，呼吸機輔助；左胸部縱切口開胸，小心分離心包膜，輕壓右側胸壁，暴露心臟，左心耳下1 mm處以7-0線結扎左冠狀動脈前降支近側端，結扎后肢體導聯心電圖J點抬高（≥0.2 mV），提示心肌梗死造模成功；假手術組僅在相應部位穿線不結扎左冠狀動脈。排除胸腔內氣體和殘留積血，逐層關胸、恢復自主呼吸拔除氣管插管，術后注射抗生素預防感染。

1.4 分組及給藥 實驗大鼠按照隨機數字表法分為假手術組，模型組，積雪草苷低、中、高劑量組，牛磺酸組，每組均18只。造模完成24 h后，假手術組、模型組大鼠灌胃等量0.9%氯化鈉注射液，各組用飲用水溶解藥物，積雪草苷低、中、高劑量組分別灌胃給藥1.62、3.24、6.48 mg/（kg·d），牛磺酸組灌胃牛磺酸藥液300 mg/（kg·d），每天早晚各1次，治療4周［5］。

1.5 標本采集與檢測 1）TTC染色觀察大鼠心肌梗死面積。治療4周后，每組隨機選取6只大鼠稱質量，麻醉并開胸取心臟，冰生理鹽水沖洗并用濾紙吸干多余水分，左心室稱質量，計算左心室質量/體質量的比值。心肌組織切為5片，置于2%TTC磷酸鹽緩沖液中，避光浸染30 min，每5分鐘翻動1次；4%多聚甲醛中固定20 h，吸干組織表面清水，采用IPP圖像分析系統進行分析，計算大鼠心肌梗死面積百分比。紅色為正常心肌，白色為心肌梗死區。2）HE染色觀察大鼠心肌組織病理學變化。治療4周后，麻醉大鼠取心臟，4%多聚甲醛固定制備石蠟切片；常規二甲苯脫水；蘇木精染色10 min，流水沖洗；鹽酸乙醇分化數秒，流水沖洗；伊紅復染30 s，梯度乙醇脫水2 min，石炭酸二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察切片。3）TUNEL法檢測心肌細胞凋亡。制備心肌組織石蠟切片，參照TUNEL試劑盒說明書進行檢測；心肌組織切片經Proteinase處理15～30 min，PBS漂洗；實驗組加TUNEL反應混合液（50 μL TaT酶+450 μL熒光素標記的dUTP液混勻）50 μL，陽性對照不加TaT酶，室溫反應60 min，PBS清洗3次，加入DAB、20%甘油緩沖液封片；滴加1滴PBS熒光顯微鏡計數，每張切片計算5個不同視野，計算TUNEL陽性細胞數。4）Western blotting檢測心肌組織蛋白表達。適量心肌組織，RIPA裂解液裂解組織，勻漿組織樣品，冰上裂解，提取總蛋白；BCA法測定蛋白濃度；變性蛋白50 μg進行SDSPAGE，濃縮膠（5%）電壓80 V，分離膠（10%）電壓120 V，電泳后轉膜至PVDF膜上；5%脫脂奶室溫封閉1 h，一抗（GRP78、PERK、CHOP、Bax、Bcl-2、Caspase-12）1∶500稀釋，4 ℃孵育過夜，TBST清洗3次；二抗1∶5000稀釋，室溫1 h，TBST清洗3次；ECL顯影，凝膠成像系統觀察，拍照，以β-actin為內參進行灰度值比較。

1.6 統計學處理 應用SPSS22.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差分析有統計學意義的，再次采用SNK-q或LSD-t進行兩兩比較；計數資料用n表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠基本情況 假手術組大鼠無死亡情況，造模過程中因麻醉、24 h急性心力衰竭、氣胸等原因死亡的大鼠20只，術后24 h存活率為81.48%。模型組術后第8天死亡1只，積雪草苷低劑量組第12天死亡1只。術后4周，假手術組大鼠18只，積雪草苷中、高劑量組、牛磺酸組大鼠各14只，模型組、積雪草苷低劑量組大鼠13只。

2.2 各組大鼠左室質量、體質量、左室梗死面積比較見表1，圖1。各組大鼠，體質量比較無顯著差異；與假手術組比較，模型組左室質量和左室質量/體質量的比值顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，不同劑量積雪草苷和牛磺酸治療后，左室質量、左室質量/體質量和左室梗死面積的比值顯著下降（P＜0.05）。與假手術組比較，模型組梗死面積顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，不同劑量積雪草苷組和牛磺酸組治療后，梗死面積均明顯下降（P＜0.05），提示積雪草苷和牛磺酸可發揮減少心肌梗死面積，保護心肌的作用。

表1 各組大鼠左室質量、體質量、左室梗死面積比較（±s）

與假手術組比較，?P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與積雪草苷低劑量組比較，#P＜0.05；與積雪草苷中劑量組比較，▲P＜0.05。下同

組別假手術組模型組積雪草苷低劑量組積雪草苷中劑量組積雪草苷高劑量組牛磺酸組n 6 6 6 6 6 6左室質量（mg）512.31±42.34724.92±60.17*654.14±54.23*△574.37±50.65*△#525.46±46.29△521.37±44.54△#▲體質量（g）226.04±15.12223.07±14.51227.10±12.19231.20±13.45230.07±14.21228.02±12.54左室質量/體質量（mg/g）2.27±0.543.25±0.65*2.46±0.57*△2.35±0.48△2.31±0.43#2.29±0.49左室梗死面積（%）—45.68±6.8437.16±6.12△23.55±5.26△#13.67±5.07△#▲10.81±5.18△#▲

圖1 TTC染色觀察心肌梗死

2.3 各組大鼠心肌細胞凋亡計數比較 見表2，圖2。TUNEL染色檢測凋亡細胞，陽性核仁計數結果顯示與假手術組比較，模型組凋亡細胞比例顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，積雪草苷各組和牛磺酸組細胞凋亡比例顯著減少（P＜0.05），提示積雪草苷和牛磺酸可減少心肌細胞凋亡比例。

表2 各組大鼠心肌細胞凋亡計數比較（%，±s）

表2 各組大鼠心肌細胞凋亡計數比較（%，±s）

組別假手術組模型組積雪草苷低劑量組積雪草苷中劑量組積雪草苷高劑量組牛磺酸組n666666心肌細胞凋亡2.17±0.0440.12±5.23*31.46±5.67*△#▲25.37±3.16*△#18.06±2.79*△#▲15.73±2.10*△#▲

圖2 各組大鼠心肌細胞凋亡情況（TUNEL染色，200倍）

2.4 各組心肌細胞形態比較 見圖3。HE染色顯示假手術組心肌纖維排列整齊，橫紋清晰，分布均勻，無水腫或壞死；模型組心肌纖維不規則，橫紋不清或缺失，大面積心肌壞死，間質水腫伴中性粒細胞浸潤；積雪草苷低、中、高劑量組和牛磺酸組心肌纖維輕度擴張，心肌纖維局灶性丟失，未見心肌壞死。

圖3 各組大鼠心肌細胞形態（HE染色，200倍）

2.5 各組內質網應激分子GRP78、PERK、CHOP蛋白表達比較 見圖4，表3。Western blotting檢測顯示，與假手術組比較，模型組GRP78、PERK、CHOP蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，積雪草苷各組和牛磺酸組GRP78、PERK、CHOP蛋白表達顯著降低（P＜0.05），而積雪草高劑量組與牛磺酸組PERK、CHOP蛋白表達水平無顯著差異。積雪草各組呈劑量依賴性降低。

圖4 各組內質網應激分子GRP78、PERK、CHOP蛋白表達

表3 各組內質網應激分子GRP78、PERK、CHOP蛋白表達（±s）

表3 各組內質網應激分子GRP78、PERK、CHOP蛋白表達（±s）

與假手術組比較，?P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與積雪草苷低劑量組比較，#P＜0.05；與積雪草苷中劑量組比較，▲P＜0.05；與積雪草苷高劑量組比較，☆P＜0.05。下同

組別假手術組模型組積雪草苷低劑量組積雪草苷中劑量組積雪草苷高劑量組牛磺酸組n 6 6 6 6 6 6 GRP780.17±0.020.84±0.05*0.71±0.06*△0.52±0.04*△#0.34±0.05*△#▲0.19±0.02△#▲☆PERK 0.16±0.010.87±0.08*0.66±0.07*△0.41±0.03*△#0.18±0.02△#▲0.17±0.01△#▲CHOP 0.17±0.010.63±0.06*0.40±0.04*△0.31±0.02*△#0.17±0.02△#▲0.16±0.01△#▲

2.6 各組凋亡蛋白Bax和Bcl-2、Caspase-12、Caspase-3蛋白表達比較 見圖5，表4。Western blotting檢測顯示，與假手術組比較，模型組Bax、Caspase-12、Caspase-3蛋白表達水平顯著升高，Bcl-2蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，積雪草苷各組隨劑量的升高Bax、Caspase-12、Caspase-3蛋白顯著降低，Bcl-2蛋白升高（P＜0.05），均呈劑量依賴性，且積雪草苷高劑量組與牛磺酸組蛋白無顯著差異。

圖5 各組凋亡蛋白Bax和Bcl-2、Caspase-12、Caspase-3蛋白表達

表4 各組凋亡蛋白Bax和Bcl-2、Caspase-12、Caspase-3蛋白表達（±s）

表4 各組凋亡蛋白Bax和Bcl-2、Caspase-12、Caspase-3蛋白表達（±s）

組別n Bax Caspase-12Caspase-3Bcl-2假手術組模型組積雪草苷低劑量組積雪草苷中劑量組積雪草苷高劑量組牛磺酸組6 6 6 6 6 60.18±0.020.75±0.04*0.61±0.10*△0.48±0.05*△#0.20±0.06△#▲0.18±0.03△#▲0.17±0.010.77±0.07*0.69±0.03*△0.40±0.03*△#0.18±0.12△#▲0.17±0.01△#▲0.47±0.060.80±0.05*0.69±0.06*△0.38±0.04*△#0.19±0.02*△#▲0.19±0.03*△#▲0.48±0.050.16±0.02*0.20±0.03*△0.26±0.04*△#0.39±0.03*△#▲0.43±0.03△#▲

3 討論

積雪草屬于傘形科植物，主要含有三萜皂苷類物質，是多版《中國藥典》的收藏品種。研究證實，積雪草對熱證、癰疽、皮膚創傷、瘢痕的治療效果良好［7］。AC是積雪草三萜皂苷類的重要成分，研究顯示，AC具有抗炎作用，可保護大鼠原代心肌細胞的缺氧復氧損傷［8］。AC對人成纖維細胞具有明顯的增殖促進作用。AC在心梗大鼠中具有明顯的抗炎、抗纖維化作用，可抑制非梗死區轉化生長因子-β1和Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達，減輕心肌梗死后心肌纖維化［5］。研究顯示，AC處理后，急性心肌梗死大鼠左心室功能得到顯著改善［9］。目前關于AC對AMI大鼠保護作用的通路研究則較少，本研究通過構建急性心肌梗死大鼠模型，探究AC對AMI大鼠心肌保護作用。根據結扎后大鼠肢體導聯心電圖J點抬高，提示造模成功。本研究中，與假手術組比較，模型組左室質量和左室質量/體質量的比值顯著增加，心肌梗死面積著增加，心肌細胞凋亡率顯著增加；AC干預后，大鼠左室質量和左室質量/體質量的比值，梗死面積、細胞凋亡比例顯著減少，HE染色顯示，模型組心肌纖維不規則，橫紋不清或缺失，積雪草苷各組和牛磺酸組心肌纖維輕度擴張，心肌纖維局灶性丟失。提示AC對模型大鼠心肌組織具有保護作用，是治療心肌梗死的潛在藥物。

近年來內質網應激通路引起了國內外學者的重視，ERS與AMI后心室重建引起的細胞凋亡關系密切。內質網是調控蛋白折疊與Ca2+穩態重要的細胞器，當機體出現缺氧、缺糖、缺血、大量自由基堆積、Ca2+穩態破壞等應激情況時均可引起內質網障礙，導致細胞凋亡［10］。UPR是內質網標記分子，應激條件下，ERS和GRP發揮保護細胞的作用，應激過度，應激時間過長，則會啟動內質網應激凋亡信號通路GRP78/PERK/CHOP，PEPK誘導CHOP表達增加，激活Caspase-12促進細胞凋亡［11］。心肌肥大心力衰竭大鼠模型中，GRP78、CHOP表達顯著增加［12］。小豬左冠狀動脈前降支放置收縮環，導致小豬心力衰竭，誘導ERS相關的CHOP、Caspase-12凋亡通路，促進心肌細胞凋亡［13］。研究報道，低糖可促進大鼠內質網應激通路的激活，促進GRP78、PERK、CHOP通路蛋白表達增加［14］。本研究顯示，AMI組GRP78、PERK、CHOP、Caspase-12蛋白表達水平顯著升高，AC處理后，積雪草苷各組GRP78、PERK、CHOP、Caspase-12蛋白表達降低，提示心肌梗死促進GRP78-PERK-CHOP的激活，AC抑制GRP78-PERK-CHOP的激活，這表明AC可通過抑制ERS通路抑制細胞凋亡。

研究顯示，CHOP凋亡通路與線粒體凋亡通路密切相關，CHOP可下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，引起促凋亡蛋白Bax易位到線粒體，發揮促凋亡作用［15］。研究報道，CHOP通過激活Caspase-12進而激活下游Caspase-3、Caspase-9的表達，促進Capase級聯反應的發生，促進細胞凋亡，促進神經損傷［16］。本研究顯示，AMI大鼠Bax蛋白表達水平顯著升高，Bcl-2蛋白水平顯著降低，AC處理后，積雪草苷各組和Tau組Bax蛋白表達降低，Bcl-2蛋白升高，提示AC可抑制細胞的凋亡以發揮其對心肌細胞的保護作用。

綜上所述，AC可以減少心肌梗死面積，降低凋亡細胞數量，改善心肌組織病理變化，其可能是通過抑制GRP78/PERK/CHOP通路的激活，抑制凋亡相關通路，發揮對心肌細胞的保護作用。