蟾龍鎮痛膏對骨癌痛大鼠脊髓MAPK信號通路的影響?

侯公瑾 柏正平 曾普華△ 潘敏求 蔣益蘭 黃惠勇

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南省中醫藥研究院，湖南 長沙 410006；3.抗腫瘤中藥創制技術湖南省工程研究中心，湖南 長沙 410006）

惡性腫瘤已經成為嚴重威脅人類健康的一大疾病，癌性疼痛是中晚期癌癥患者常見的癥狀，其中60%～80%的患者會發生癌性疼痛［1］，而晚期患者中90%承受著中重度疼痛及爆發性疼痛［2］，嚴重影響患者日常生活、睡眠、精神心理等。世界衛生組織WHO提倡“三階梯止痛療法”有效改善了癌性疼痛的治療狀況，但部分因藥物治療帶來的副作用同樣讓人難以忍受。蟾龍鎮痛膏是湖南省中醫藥研究院附屬醫院腫瘤科院內制劑，由湖南省名中醫柏正平教授通過檢索大量古今文獻［3］，結合全國名老中醫潘敏求教授治療癌性疼痛臨床經驗確立［4］。前期臨床使用發現其對輕中度癌性疼痛具有較好療效。本研究建立骨癌痛大鼠模型并以蟾龍鎮痛膏進行干預，探討蟾龍鎮痛膏對大鼠的鎮痛作用，并基于絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路探討可能的鎮痛機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與動物 實驗用Walker256乳腺癌細胞株購于上海滬震生物科技有限公司。SPF級雌性SD大鼠50只，7周齡，體質量（200±10）g，購于長沙市天勤生物技術有限公司，合格證號：SCXK（湘）2014-0011。

1.2 試藥與儀器 1）試藥：蟾龍鎮痛膏（湖南省中醫藥研究院附屬醫院藥劑科制備；由蟾皮、生川烏、雄黃、芒硝、乳香、沒藥、血竭、醋延胡索、明礬、龍葵、冰片組成，外貼凝膠膏藥，院內制劑生產批號20171212-02）；扶他林（雙氯芬酸二乙胺乳膠劑，北京諾華制藥有限公司，國藥準字H19990291）。磷酸化38蛋白（p-p38 MAPK）抗體（美國CST，貨號#4511）；磷酸化細胞外信號調節激酶（p-ERK MAPK）抗體（美國CST，貨號#4370）；β-actin抗體（美國Proteintech，貨號60008-1-Ig）；BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo Scientific，貨號23227）。2）儀器：PVDF膜（美國Bio-RAD，貨號1620177）；電泳儀（美國Bio-RAD，貨號164-5050）；電泳槽（中國北京六一，貨號DYCZ-24EN）；轉膜儀（中國北京六一，貨號DYCZ-40A）；電動玻璃勻漿器（日本新芝，貨號DY89-1）；臺式冷凍離心機（中國深圳黑馬，貨號TGL-18R）；熱板測痛儀（中國浙江寧海白石電子醫藥儀器廠，貨號GJ8402-0021）；Von frey纖毛機械刺激針（美國North Coast，貨號12775-99）。

1.3 分組與造模 將50只雌性大鼠隨機分為空白組、模型組、蟾龍鎮痛膏常規劑量組、蟾龍鎮痛膏高劑量組和扶他林組，每組10只，除空白組外其他各組進行造模。造模用Walker256乳腺癌細胞懸液（細胞濃度為4×104個/mL），參照Medhurst［5］報道的方法建立骨癌痛大鼠模型。采用10%水合氯醛（300 mg/kg）對大鼠進行腹腔麻醉，仰臥位固定于操作臺上，止血鉗夾取四肢無反應后取1 mm微型骨鉆于右側后肢白色髕韌帶下方脛骨上段部位打孔，刺入骨髓腔后用5 μL微量取樣器注入含有Walker 256乳腺癌細胞懸液4 μL，注射完畢后用無菌骨蠟封閉鉆孔，生理鹽水沖洗，縫合傷口，消毒傷口后撒青霉素預防感染。對造模后的大鼠進行疼痛閾值評估驗證造模是否成功。

1.4 給藥方法 造模14 d后開始外敷相應藥物：蟾龍鎮痛膏常規劑量組（蟾龍鎮痛膏0.56 g/kg）、蟾龍鎮痛膏高劑量組（蟾龍鎮痛膏1.12 g/kg）、扶他林組（雙氯芬酸二乙胺乳膠劑0.08 g/kg）。蟾龍鎮痛膏外敷大鼠背部中央去毛皮膚，醫用橡皮膠帶環周固定2圈，保證每日接觸8 h以上；扶他林外涂大鼠背部中央去毛皮膚；每日10∶00給藥1次，連續21 d。空白組、模型組不作任何干預。于溫度（22±1）℃，濕度50%，12 h光照12 h黑暗環境飼養，自由攝食飲水。

1.5 標本采集與檢測 1）大鼠脛骨HE染色。實驗結束后，脊椎脫臼法處死大鼠取右側脛骨，固定于4%多聚甲醛液體中，24 h后用10%EDTA（pH7.2），4℃脫鈣處理；30 d后取大鼠右側脛骨上端部位進行切片，60℃烤片12 h；將切片于二甲苯溶液中，放置3次，每次20 min。然后依次在100%、100%、95%、85%和75%乙醇，每級放置5 min。再用蒸餾水浸洗5 min；蘇木素染10 min，蒸餾水沖洗，緩沖液返藍；伊紅染3～5 min，蒸餾水沖洗；梯度酒精（95%～100%）脫水，每級5 min。取出后于二甲苯溶液中放置2次，每次10 min，用中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察組織形態。2）大鼠熱痛覺縮足反射潛伏期（PWL）。實驗開始后，每7天測試1次，測試時將熱板測痛儀溫度設定為55℃后將大鼠置于測試平臺上，參照Yao［6］報道的方法，記錄大鼠出現舔后足的時間為PWL，上限值為20 s以避免燙傷大鼠皮膚，取3次平均值，每次測試間隔5 min。持續至造模后35 d。3）大鼠機械痛覺縮足反射閾值（PWT）。實驗開始后，每7天測試1次，測試時將大鼠放入底部為金屬篩網的有機玻璃籠中適應5 min后，參照Chaplan［7］報道的方法，用Von Frey測痛纖絲垂直刺激大鼠后足底部中央皮膚，使纖絲彎曲至大鼠出現縮足反射，若未出現發射則更換更大強度測痛纖絲。從0.6 g開始，每個強度的刺激為5次，每隔15 s進行一次機械刺激，將出現縮足表現3次以上的最小Von Frey纖維強度記錄為PWT，上限值為15.0 g。持續至造模后35 d。4）蛋白質印跡（Western blotting）法檢測大鼠脊髓pp38、p-ERK表達。實驗結束后，將大鼠處死，取脊髓L4～L6段取0.025 g，加入200 μL（含蛋白酶抑制劑）RIPA裂解液，置冰浴中勻漿機勻漿15～20 s，靜置30 min，12000 r/min離心，4℃，15 min，將離心后的上清分裝轉移到0.5 mL的離心管中100℃加熱5 min，BCA蛋白含量測定。將大鼠脊椎用液氮研磨后加入RIPA置于冰上裂解，并將裂解后的蛋白樣品轉移至100℃水浴加熱5 min使蛋白變性。蛋白定量，統一總蛋白上樣量為40 μg。聚丙烯酰胺凝膠電泳后將gel轉移至PVDF膜上，恒流200 mA濕轉105 min。將轉膜后的PVDF膜封閉室溫1h（封閉液：PBST+5%脫脂奶粉），分別加pp38、p-ERK抗體（兔抗鼠）按說明書，1∶1000稀釋，4℃過夜。棄一抗，用含有0.05%Tween-20的緩沖液（PBS-T）洗膜3次，10 min/次，加入二抗（1∶5000稀釋），室溫孵育1 h。棄二抗，PBS-T洗去多余抗體，3次，10 min/次，加入發光顯示液體，曝光。電泳條帶經Image J軟件處理，分析空白組、模型組條帶與各對照組條帶面積、灰度比值。

1.6 統計學處理 應用SPSS18.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠脛骨病理HE染色比較 見圖1。空白組組織結構未見異常，模型組鏡下可見骨髓腔內充滿大量腫瘤細胞，細胞結構、形態、大小差異明顯，細胞核、質比異常，周圍骨質結構部分缺失，骨小梁結構破壞，部分骨皮質可見腫瘤細胞，提示大鼠脛骨接種Walker256細胞建立骨轉移模型成立。

圖1 脛骨病理比較（HE染色，400倍）

2.2 各組大鼠疼痛行為學比較 見表1～表2。造模后模型組、蟾龍鎮痛膏常規劑量組、高劑量組PWL、PWT較空白組明顯下降，提示大鼠疼痛閾值降低，骨癌痛大鼠模型造模成功；藥物干預后蟾龍鎮痛膏正常組、蟾龍鎮痛膏高劑量組、扶他林組PWL、PWT較模型組上升（P＜0.05），提示藥物干預能提高大鼠疼痛閾值；蟾龍鎮痛膏常規劑量組、高劑量組、扶他林組組間差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠熱痛覺縮足反射潛伏期（PWL）比較（s，±s）

表1 各組大鼠熱痛覺縮足反射潛伏期（PWL）比較（s，±s）

與模型組比較，?P＜0.05。下同

組別空白組模型組蟾龍鎮痛膏常規劑量組蟾龍鎮痛膏高劑量組扶他林組0d 14.47±1.5013.67±1.4113.70±1.5814.33±1.1114.73±0.787d 13.50±1.60*7.33±1.948.37±1.109.53±2.088.53±1.6114d 12.53±1.51*5.33±1.595.00±1.115.40±1.765.67±1.8521d 14.73±1.46*5.27±1.728.73±0.95*6.67±0.779.87±0.89*28d 13.27±1.59*3.67±1.138.30±1.17*7.67±1.21*8.67±0.79*35d 15.07±0.91*3.63±0.7111.67±1.28*10.70±1.16*9.70±1.62*

表2 各組大鼠機械痛覺縮足反射閾值（PWT）比較（s，±s）

表2 各組大鼠機械痛覺縮足反射閾值（PWT）比較（s，±s）

組別空白組模型組蟾龍鎮痛膏常規劑量組蟾龍鎮痛膏高劑量組扶他林組0d 11.22±2.9312.86±2.2512.24±2.6811.20±1.6411.82±1.027d 11.60±1.42*6.62±2.897.64±1.596.12±1.817.34±2.5814d 11.24±1.78*4.24±1.084.40±2.784.84±2.204.86±1.4921d 11.26±2.84*3.84±1.338.72±1.48*9.86±2.29*9.52±2.77*28d 12.46±1.59*3.54±2.8811.52±2.67*9.22±2.34*10.14±2.91*35d 12.86±1.63*4.52±1.5312.14±1.13*12.46±2.86*11.08±1.56*

2.3 各組大鼠脊髓p-p38、p-ERK表達比較 見圖2，圖3，表3。模型組p-p38、p-ERK表達較空白組、蟾龍鎮痛膏常規劑量組、蟾龍鎮痛膏高劑量組和扶他林組明顯上升（P＜0.05），提示骨癌痛大鼠模型中MAPK信號通路中p-p38、p-ERK大量激活，藥物干預后，能夠抑制p-p38、p-ERK的表達，其中ERK2較ERK1更明顯。

3 討論

圖2 各組大鼠脊髓p-p38灰度圖

圖3 各組大鼠脊髓p-ERK灰度圖

表3 各組大鼠脊髓p-p38、p-ERK表達比較（s，±s）

表3 各組大鼠脊髓p-p38、p-ERK表達比較（s，±s）

組別空白組模型組蟾龍鎮痛膏常規劑量組蟾龍鎮痛膏高劑量組扶他林組n 1010101010 p-p387.07±0.48*38.92±0.9325.40±1.32*23.87±0.82*21.09±1.13*p-ERK17.56±1.42*59.74±1.2627.09±2.93*35.48±2.13*52.98±2.44*p-ERK24.27±1.63*54.44±1.3217.78±1.43*9.97±0.88*9.36±0.93*

近年來研究發現MAPK信號通路在癌性疼痛的產生發展過程中具有重要作用［8-9］。在各種傷害性疼痛產生過程中p38/MAPK大量活化，引起磷脂酶A2產生花生四烯酸，誘導細胞外前列腺素E2增加，刺激神經元引起疼痛［10］；在脊髓中p38/MAPK信號通路可以通過激活核因子κB（NF-κB）影響基因轉錄，促使小膠質細胞釋放IL-1β、TNF-α、IL-6，激活神經元上相應受體，引起疼痛在中樞的傳遞［11］。有文獻表明，ERK/MAPK通路參與了痛覺超敏的過程，引起疼痛效應的放大［12］，在注射完全弗氏佐劑形成的關節炎模型中，使用MEK（ERK上游激酶）抑制劑PD98059可以明顯減輕關節炎模型痛覺超敏［13］。本實驗中發現，骨癌痛大鼠模型中p-p38、p-ERK1/2表達明顯上升，提示了其在骨癌痛的發生發展中扮演了重要角色，而使用蟾龍鎮痛膏、扶他林干預后，大鼠痛閾下降，脊髓p-p38、p-ERK1/2表達下降，提示了蟾龍鎮痛膏和扶他林可以抑制脊髓p-p38、p-ERK1/2的活化。

臨床上目前對癌性疼痛的治療主要采用WHO提倡的“三階梯”止痛療法，其有效降低了癌痛患者的癥狀［14］。扶他林屬于第一階梯非甾體抗炎鎮痛藥，可以抑制前列腺素合成，從而降低炎性介質的釋放，臨床上對于各種類型疼痛具有比較好的療效，對于輕中度骨癌痛也有一定療效［15］，但也有諸多不良反應，如肝腎功能損傷、惡心嘔吐、皮膚過敏、消化道潰瘍、出血等。第二、三階梯阿片類鎮痛藥物也同樣有惡心嘔吐、便秘、呼吸抑制等不良反應，同時具有明顯的藥物依賴作用，隨著病情的進展，常常會引起劑量的不斷增加［16］。中醫學自古就有各種治療疼痛的記載，包括中藥內服法、外治法、針刺法、艾灸法等多種治療方式，其中外治法也包含外用膏藥、擦劑、穴位敷貼等多種形式，在臨床中運用較多。外用膏藥可以避免內服藥對集體的刺激［17］，效果也較內服法更加明顯［18］，在臨床適用于腫瘤患者，具有簡便實用、療效可靠、安全性高的特點。

蟾龍鎮痛膏以性味辛溫，行氣通絡止痛的雄黃、生川烏、血竭、醋延胡索為君藥；其中雄黃辛溫散結止痛，川烏性熱味苦，可增強溫通的療效，麻醉止痛；血竭活血止痛，散瘀生新；延胡索性溫，味辛苦，與諸藥性味相合，是止痛專用藥，四藥合用，可溫陽散結、行氣止痛。蟾皮、芒硝、龍葵等化痰散結、利水消腫、解毒止痛，能化絡脈痰濁之邪，達到通絡止痛的目的。輔以乳香行氣通絡、活血止痛，沒藥散瘀止痛；加用冰片、明礬辛香的藥物，芳香走竄，增強皮膚滲透效果以利透皮吸收，也是止痛良藥，可清熱止痛，消腫定痛，并中和諸多溫燥藥物，以達更好的治療功用，又可助其他藥物吸收擴散，上述組成使本方寒熱并用，通絡止痛，更具解毒散結功效，以透皮藥物為引藥直達病痛之所，共奏解毒散結，活血行氣，通絡止痛之功效。

本研究初步證實蟾龍鎮痛膏對骨癌痛大鼠具有提高疼痛閾值的作用，同時可降低脊髓p-p38、p-ERK1/2表達。其鎮痛作用的機制可能與抑制脊髓MAPK信號通路中p38、ERK1/2活化有關，為探索蟾龍鎮痛膏鎮痛作用機制奠定了一定基礎，同時為臨床應用蟾龍鎮痛膏治療癌性疼痛提供了依據。臨床治療癌性疼痛應通過中西醫結合綜合治療的方式，重視辨證與辨病相互結合才能獲得較好的效果。但蟾龍鎮痛膏組方藥物較多，其有效成分及鎮痛機制仍需進一步通過實驗探索證實。