BBO超低溫探頭在分析測試中的應用

艾 惠，高培峰

（北京理工大學 分析測試中心，北京 102488）

核磁共振波譜儀（nuclear magnetic resonance，NMR）作為物質結構鑒定的重要大型儀器之一，具有快速、準確、無損、分辨率高等優點，可以提供分子的化學結構和分子動力學信息，已被廣泛應用于分子結構解析以及物質理化性質表征[1]，是從事有機化學、藥物化學、生物化學、石油化學、化學工業、材料化學、化學生物學、生命科學及食品科學等方面研究的重要工具[2-8]。

近年來，超低溫探頭得到了很大的發展，以其卓越的檢測靈敏度而得到廣泛應用[9]。本文結合我校分析測試中心Bruker Ascend 700 MHz核磁共振波譜儀、超低溫探頭的結構、技術指標及應用范圍等方面，介紹了BBO超低溫探頭在分析檢測中的應用。

1 超低溫探頭分類及原理

探頭是連接樣品和譜儀之間的紐帶。根據雜核線圈和氫核線圈在探頭內的位置不同，可以分為正相探頭（雜核在內，碳譜靈敏度高）和反相探頭（氫核在內，氫譜靈敏度高）（見圖 1）。共振頻率較低的原子核由于其γ值較小或天然豐度較低，共振信號較弱，因而接收線圈在里面可以提高靈敏度。

超低溫探頭由高溫超導薄膜材料制成，當樣品溫度由溫控單元維持時，使用閉環或開環制冷系統使超導線圈冷至25 K，消除譜圖的電噪聲，提高檢測靈敏度。過去十幾年內超低溫探頭的發展顯著增加了核磁的靈敏度，使以前認為樣品量太少無法檢測的樣品的測試成為可能。目前應用比較廣的兩種低溫探頭是基于閉環循環的氦冷卻器低溫探頭（CryoProbe）和開環的液氮冷卻系統低溫探頭（CryoProbe Prodigy）。低溫探頭工作原理，發射/接受線圈和調諧匹配電路維持在極低溫度，以降低源自導體中的電子熱運動所致的噪聲（Johnson-Nyquist噪聲）；在低溫下，純金屬的電阻進一步下降，額外降低了噪聲；前放、過濾器和發射-接收-轉換也被冷卻，以提升電子器件的噪聲指數。探頭和電子降低的噪聲增強了信噪比，與常規室溫探頭相比，CryoProbe探頭信噪比最多增加 5倍，CryoProbe Prodigy增加2～3倍。冷卻系統控制了所有功能，一旦處于冷卻狀態，CryoProbe探頭和常規探頭一樣使用，盡管離低溫探頭的冷卻區域只有 1 mm遠，樣品能夠在設定的溫度下穩定。根據探頭不同，溫度可調范圍在-40～135 ℃之間。

圖1 反相探頭與正相探頭示意圖

2 BBO超低溫探頭應用實例

BBO CryoProbe為正相探頭，在最廣泛的核范圍內提供了最高的靈敏度，設計為同時觀測和反相檢測。除了1H和19F外，所有在31P和15N的NMR核都能夠被觀測/照射。所有這些核能夠自動選擇，利用ATM選項進行優化調諧和匹配，配有主動屏蔽的單軸Z軸梯度，用于直徑為5 mm的樣品。BBO H&F（BBO Cryo Probe）探頭設計增強了19F和13C的靈敏度。19F可以在1H通道內調節到19F，不能進行觀測1H對19F去耦（反之亦然）實驗。除了表征的觀測BB、對1H去耦的實驗外，BBO H&F探頭還能觀測 BB、對19F去耦。

Bruker Ascend 700 MHz 核磁共振波譜儀的BBO H&F寬頻超低溫探頭，用壓縮低溫氦氣來冷卻探頭檢測線圈到20 K附近和前放電子線圈到77 K附近，最大程度降低了可檢測到的電子熱噪聲，探頭檢測靈敏度可提高3 ～ 4倍以上，檢測時間減少16倍或者樣品濃度減少4倍，對13C靈敏度最高，對31P到15N范圍內的靈敏度提高了 4倍多，對1H的靈敏度提高了 3倍多，對19F的靈敏度提高了6倍多。其與700 MHz BBO常溫寬頻探頭的技術指標見表1。對于不常用核、低豐度/低靈敏度核、天然產物化學或代謝組學等樣品量小的檢測提供了很好的解決辦法。

表1 BBO H&F寬頻超低溫探頭與常溫寬頻探頭技術指標

圖2是質量分數為0.1%乙基苯用700 MHz BBO H&F寬頻超低溫探頭和400 MHz BBO常溫寬頻探頭測試C13CPD譜圖的比較（δ為化學位移）。其中，700 MHz掃描次數為16次，400 MHz掃描次數為1024次。從圖2可以看出，用700 MHz BBO H&F寬頻超低溫探頭測試靈敏度、天然豐度均很低且含量很低樣品的碳譜掃描16次即可得到分辨率很高的碳譜譜圖，而用400 MHz BBO常溫寬頻探頭測試則須掃描1024次才能達到類似的分辨率。

圖2700 MHz BBO H&F寬頻超低溫探頭（NS = 16）與400 MHz BBO常溫寬頻探頭（NS = 1024）C13CPD譜圖

圖3是僅用5.5 h采樣得到的200 μg Taxal （paclitaxel，C47H51NO14，MW = 853.9）寬帶去耦碳譜和DEPT-135譜。同時，2D HSQC譜也證明了在采樣時間僅為1 h時，BBO H&F寬頻超低溫探頭卓越的1H靈敏度，其測試結果均比 DHC超低溫探頭測試時間縮短了一倍多[9]。

圖4是在700 MHz BBO 寬頻超低溫探頭上用反轉門控去耦方法測試3 h得到的氮譜譜圖。圖5是在700 MHz BBO 寬頻超低溫探頭上測試15 min得到消除背景前后的一維11B譜圖。圖6是在700 MHz BBO寬頻超低溫探頭上測試0.5 h得到的一維119Sn和51V譜圖。圖4—圖6說明700 MHz BBO 寬頻超低溫探頭對于低靈敏度、不常用核也具有非常杰出的靈敏度。以上實例證明700 MHz BBO寬頻超低溫探頭對氫、碳及雜核均有卓越的靈敏度，是檢測低豐度/低靈敏度核、不常用核及天然產物化學的優先選擇。

圖3 在700 MHz BBO H&F寬頻超低溫探頭測試得到的200 μg Taxal碳譜

圖4 在700 MHz BBO寬頻超低溫探頭上用反轉門控去耦方法測試3 h得到的15N譜圖

3 維護及開放共享服務

圖5 在700 MHz BBO寬頻超低溫探頭測試15 min得到的11B譜圖

圖6 在700 MHz BBO寬頻超低溫探頭上測試得到的一維雜核譜圖

儀器維護保養是一項經常性的或定期的工作，也是一件技術性較強的工作[10]。超低溫探頭的維護保養需定期進行，每10000 h需對冷柜中的冷頭和膜泵進行維護保養；每20000 h需對冷柜中的分子泵和室內機中氦過濾器進行維護保養；每月對室外機進行定期清理清洗，春天柳絮紛飛的季節需每周清理；定期查看監控筆記本電腦等，保證探頭的正常運行。

目前整臺儀器已實行開放共享服務，極大地提高了使用效率。兩年多以來，超低溫探頭的高分辨率及高靈敏度的檢測條件，為我校師生服務取得了一定的成果。我校王蘇寧教授課題組結合超低溫探頭測試核磁氫譜、碳譜、硼譜及二維譜等表征手段在 Chem.Sci.[11-12]和 Macromolecules[13]等雜志發表文章；陳甫雪教授課題組結合超低溫探頭測試核磁氮譜在 Chem.Commun.[14]雜志發表文章；李曉芳教授課題組結合超低溫探頭測試核磁氫譜和碳譜在 Macromol. Rapid Commun.[15]和Org. Lett.[16]等雜志發表文章；胡長文教授課題組結合超低溫探頭測試核磁氫譜、碳譜和磷譜在Angew. J. Org. Chem.[17]等雜志發表文章。

4 結語

核磁共振波譜儀在諸多學科和研究領域均得到了廣泛的應用，也逐漸成為教學科研中的重要設備。超低溫探頭卓越的靈敏度為分析化學、蛋白質組學、代謝組學、生物制藥及新材料開發等領域提供了一流的檢測技術，成為推動學科發展的有力工具。