半夏生物堿提取方法及抗氧化性研究

張 楠，郭春延，薛晶晶，楚建周，姚曉芹

（河北大學 生命科學學院，河北 保定 071002）

半夏Pinellia ternate(Thunb.) Breit.屬于天南星科多年生草本植物，廣泛分布于中國、日本和韓國的大部分地區。半夏已在中國傳統醫學中使用了2000多年[1]，并被記錄在中國藥典中[2]，是治療咳嗽，嘔吐，感染和炎癥的常見中藥[3-4]。

半夏塊莖含有多種化學元素，先前關于半夏塊莖化學成分的研究表明，生物堿是半夏的主要活性成分[5]，在許多生理功能中具有顯著的生物活性。因此，生物堿可以作為半夏質量控制指標之一。

半夏生物堿含量測定及其抗氧化性研究是我院大學生綜合性實驗之一。傳統提取生物堿含量方法為索氏提取和旋轉蒸餾法[6]，但這兩種方法在提取過程中不僅耗能，而且耗時，并且需要配備多臺索氏提取器和旋轉蒸發儀。本文主要研究了不同提取方法對半夏生物堿含量的影響，并對半夏生物堿的抗氧化性進行分析，提出了一種生物堿優化提取的改進方法。該方法簡便、快速、準確，可用于評價半夏品質，同時也可以應用于大學生綜合性實驗中。

1 材料和方法

1.1 材料、儀器和試劑

材料：半夏塊莖于2017年9月10日購買于甘肅省隴南市西河縣（北緯 34°02′，東經 105°3′，海拔1500 m），半夏塊莖的直徑約為0.5～2.0 cm，于60 ℃烘箱中干燥，用粉碎機粉碎成粉末，并過60目篩，裝在自封袋中備用。

儀器：電熱鼓風干燥箱（GZX-9140MBE，上海博訊實業有限公司醫療設備廠），紫外分光光度計（722型，上海舜宇恒平科學儀器有限公司），數控超聲波清洗器（PS-40A型，功率240 W，深圳市康杰洗凈電器有限公司），電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司），水浴鍋（金壇市晶波實驗儀器廠），離心機（Multifuge 1S-R D-37520 Osterode made in Germany）等。

試劑：鹽酸麻黃堿（NICPBP，171241-201508），氨水，氯仿，檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，溴麝香草酚藍溶液，鄰苯三酚，Tris-HCl緩沖液，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，抗壞血酸，鄰二氮菲，過氧化氫，硫酸亞鐵，乙醇，1,1-二苯基-2-苦基肼基（DPPH）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品溶液制備

精準稱取 105 ℃下干燥至恒重的鹽酸麻黃堿標準品10.4 mg，于100 mL容量瓶中用蒸餾水溶解，配制成含有0.104 g/L濃度的鹽酸麻黃堿溶液。

1.2.2 標準曲線繪制

準確量取鹽酸麻黃堿溶液標準品0.2，0.35，0.50，0.65，0.80 mL置于分液漏斗中，分別加蒸餾水至1.0 mL；將10 mL、pH 5.40的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，1 mL、質量分數為0.1%溴百里酚藍溶液和10 mL氯仿依次加入分液漏斗中；振蕩1 min后將混合物靜置1 h。于416 nm波長下測量氯仿層的吸收值。

1.2.3 不同提取方法

將0.5 g半夏粉末與0.5 mL、體積分數為25%氨水和5 mL氯仿混合，采用5種不同的提取方法提取得樣品溶液：（1）冷浸24 h；（2）超聲1 h；（3）熱浸24 h；（4）超聲1 h和冷浸24 h；（5）冷浸24 h和超聲1 h。

1.2.4 提取時間和溫度對生物堿含量的影響

在1.2.3節中篩選出最佳提取方法的在此基礎上，進一步單因素分析了提取時間和提取溫度對生物堿提取的影響。提取時間設置6個水平：1 h，3 h，6 h，12 h，24 h。提取溫度設置4個水平：25 ℃，30 ℃，35 ℃，40 ℃。

1.2.5 生物堿的測定

生物堿含量的測定參考文獻[7]的方法并稍作修改。生物堿提取溶液5000 r/min離心5 min，將2 mL提取液、8 mL氯仿、10 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 5.40）和1 mL 0.1%溴麝香草酚藍溶液混合，振蕩1 min后將混合物靜置1 h。于416 nm波長下測定包含生物堿的氯仿層溶液吸收值。

1.2.6 穩定性，精密度和回收率測定

室溫下5 h內每隔1 h對半夏樣品溶液進行測定，用相對標準偏差（RSD）表示樣品的穩定性。對5份樣品溶液分別連續測定10次，用相對標準偏差（RSD）表示方法的精密度。通過回收測試法研究該方法的準確性，用回收率表示。

1.3 抗氧化能力的測定

1.3.1 超氧陰離子自由基清除率的測定

超氧陰離子自由基清除率測定采用文獻[8]的方法并進行少量修改。將1 mL樣品溶液、4 mL Tris-HCl緩沖液（0.05 mol/L，pH 8.2）和1 mL鄰苯三酚溶液（0.2 mmol/L）混合，置于25 ℃水浴鍋中保溫4 min；用2滴濃HCl終止混合溶液反應，于325 nm波長下測定吸光度。超氧陰離子自由基清除率γ1計算如下：

其中，A0是對照溶液的吸光度，As是樣品溶液的吸光度。

1.3.2 羥基自由基清除率測定

羥基自由基清除率測定采用文獻[9]的方法并進行少量修改。將1 mL樣品溶液、1 mL鄰二氮菲溶液（0.75 mmol/L）、2.0 mL磷酸緩沖液（0.2 mol/L pH 7.4）、1 mL硫酸亞鐵溶液（0.75 mmol/L）和1 mL H2O2（0.01%）混合，37 ℃水浴鍋下保溫60 min，于536 nm下測量吸光度。羥自由基清除率γ2計算如下：

式中，As為半夏樣品溶液的吸光度值，A1為無樣品溶液的吸光度值，A2為無樣品溶液和H2O2的吸光度值。

1.3.3 DPPH自由基清除率測定

DPPH自由基清除率采用文獻[10]的方法并稍作修改。將2 mL DPPH溶液加入到2 mL樣品溶液中，并在室溫且黑暗中靜置30 min，于517 nm樣品溶液吸光度。DPPH自由基清除率γ3計算如下：

式中，A0為對照溶液的吸光度值，As為樣品溶液的吸光度值，A3為無DPPH的吸光度值。

1.3.4 數據分析

采用 SPSS（Statistical Package for the Social Science）13.0軟件對數據進行方差分析和顯著性檢驗（p＜0.05），采用 Excel 2007作圖。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

圖1表明鹽酸麻黃堿標準品與吸光度的關系，以鹽酸麻黃堿濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程為y= 8.0584x+ 0.0141，R2=0.9961（n= 5）。

圖1 標準液濃度-吸光度曲線

2.2 提取方法對半夏塊莖中生物堿含量的影響

半夏生物堿經堿化后用氯仿溶液提取，提取方法一般包括超聲提取、回流提取、冷浸等。游素碧等[11]的實驗結果表明，冷浸提取和超聲提取對半夏生物堿提取率的影響差異不顯著。李婷[12]報道回流提取和超聲提取方法對生物堿含量沒有顯著影響。本研究提出一種熱浸提取生物堿的方法，并且和低能耗的超聲波和冷浸提取方法進行比較。5個重復的平均值見圖2，圖2表明，不同提取方法對半夏生物堿提取率由高到低依次為：C3（熱浸24 h）的提取率 ＞ C2（超聲1 h）的提取率 ＞ C4（超聲1 h和冷浸24 h）的提取率 ＞ C5（冷浸24 h和超聲1 h）的提取率 ＞ C1（冷浸24 h）。

圖2 提取方法對半夏生物堿含量的影響

2.3 熱浸時間和溫度對半夏生物堿含量的影響

由圖2可知，本實驗條件下篩選出的半夏塊莖生物堿最佳提取方法為熱浸，在此基礎上本文進一步研究了熱浸時間和溫度對生物堿提取的影響。由圖3可知，35 ℃下提取時間對半夏生物堿含量沒有顯著影響。因此推薦1 h。

圖 4表明，提取溫度在 35 ℃和 40 ℃下，半夏塊莖生物堿含量明顯高于 25 ℃和 30 ℃下半夏塊莖中生物堿含量，并且生物堿含量在提取溫度 35 ℃和40 ℃之間沒有顯著差異。因此，提取生物堿的最佳熱浸溫度推薦35～40 ℃。

圖3 提取時間對半夏生物堿含量的影響

圖4 提取溫度對半夏生物堿含量的影響

2.4 穩定性、精確度和回收率

樣品溶液按照最佳提取方法進行提取和測定，于416 nm下每隔1 h連續測量樣品溶液5次。結果表明，樣品溶液在5 h內RSD值為0.341 %（n= 6），表明穩定性符合有關規定。

取標準液3.0 mL，按照1.2.5節方法進行測定，在416 nm波長下連續測定10次的RSD = 0.052%，表明測試精密度很好。

精確稱取半夏塊莖粉末5份，每份0.5800 g，準確加入質量濃度為1.3×10-5g/mL 10 mL鹽酸麻黃堿標準品溶液，按最佳提取方法進行提取，其結果平均回收率為102.6%。

2.5 半夏塊莖抗氧化分析

生物體內活性氧類物質是生物有氧代謝過程中的一種副產品，包括超陽陰離子、羥自由基等含氧自由基，也包括過氧化氫、單線態氧等非自由基形式的含氧分子[13-14]。正常情況下，植物體內的活性氧類物質代謝處于動態平衡[15]。然而，各種生物或非生物脅迫能夠擾亂細胞的代謝平衡，從而導致活性氧類物質積累，高濃度的活性氧類物質對生物有機體極其有害。另外，DPPH自由基是一種穩態的氮中心自由基，廣泛用來評估抗氧化劑的自由基清除活性[16-17]。本文通過對半夏生物堿的超氧陰離子自由基、羥基自由基和DPPH自由基的清除能力測定可知，半夏DPPH自由基清除活性顯著高于超氧自由基清除活性和羥自由基清除活性（見圖5），證明半夏的DPPH自由基清除能力強于其他兩種自由基清除能力。

圖5 半夏抗氧化性清除率分析

3 結論

本實驗得出半夏生物堿的最佳提取方法為熱浸，提取最佳時間為1 h，最佳溫度為35～40 ℃，該提取方法操作簡便，并且省時，可以應用于大學生綜合性實驗設置中。通過對半夏塊莖抗氧化性分析可知，半夏塊莖中DPPH自由基清除能力顯著高于超氧自由基清除活性和羥自由基清除活性。