乏氧環(huán)境下TIGAR 線粒體定位介導(dǎo)食管癌乏氧輻射抵抗

姚奇?zhèn)?吳海山 黃志宇 李建成

食管癌是常見的消化道腫瘤，其發(fā)病率和死亡率位居我國惡性腫瘤的第4位[1]。放療是食管癌治療的重要手段之一，但放射治療及各種增敏方法效果不理想[2-3]。目前研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)實(shí)體瘤能產(chǎn)生乏氧區(qū)域，局部乏氧作為一個(gè)重要的腫瘤微環(huán)境特征，被認(rèn)為是導(dǎo)致腫瘤放療抵抗最為關(guān)鍵的因素[4-6]。TIGAR，即TP53 誘導(dǎo)的糖酵解及凋亡調(diào)節(jié)蛋白，是p53蛋白下游調(diào)節(jié)細(xì)胞葡萄糖代謝的重要蛋白，與多種實(shí)體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7-9]。然而對(duì)于TIGAR與乏氧食管癌細(xì)胞輻射敏感性的研究，目前尚未見國內(nèi)外報(bào)道，因此，本實(shí)驗(yàn)研究了乏氧對(duì)人食管癌細(xì)胞TIGAR 線粒體定位的作用，以及TIGAR 線粒體定位對(duì)其放射敏感性的影響。以期更全面地闡明食管癌乏氧放療抵抗的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

食管癌細(xì)胞（ECA109、KYSE410、KYSE450）購自中科院上海細(xì)胞庫。細(xì)胞線粒體分離試劑盒、活性氧檢測試劑盒購于上海碧云天公司；慢病毒包裝由上海吉?jiǎng)P基因合成；抗體購于美國CST公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人食管癌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS的 RPMI1640 培養(yǎng)基，37℃、5%CO2濃度下，于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 Western blot檢測蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞全蛋白及線粒體：用RIPA裂解細(xì)胞，4℃下高速離心取上清液，采用BCA蛋白測定蛋白濃度后蛋白變性。提取線粒體蛋白采用細(xì)胞線粒體分離試劑盒提取。采用SDS-PAGE進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL發(fā)光試劑顯色，于暗室中壓片，洗片，晾干，掃描儀掃描圖像。

1.2.3 細(xì)胞乏氧及輻射 細(xì)胞培養(yǎng)于Thermo厭氧培養(yǎng)箱（氧濃度1%）20 h后，將培養(yǎng)板置于醫(yī)用直線加速器下，采用6MV-X射線照射，劑量率350 cGy/min，SSD=100 cm，照射野40×40 cm。

1.2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測食管鱗癌細(xì)胞增殖情況 計(jì)算不同照射劑量組的細(xì)胞克隆形成率和存活分?jǐn)?shù)。運(yùn)用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行多靶單擊模型曲線擬合，模型公式為：SF=1-（1-e-D/D0）N。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS 22.0版本統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)分析相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同食管癌細(xì)胞內(nèi)TIGAR的線粒體定位水平

不同食管癌細(xì)胞（ECA109、KYSE410、KYSE450）分別提取細(xì)胞總蛋白及線粒體蛋白進(jìn)行Western blot（WB）分析，結(jié)果顯示KYSE410細(xì)胞中TIGAR在線粒體中的表達(dá)最高，KYSE450細(xì)胞最低（圖1）。

2.2 乏氧誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞TIGAR的線粒體定位：

WB檢測乏氧及常氧環(huán)境下TIGAR在細(xì)胞及線粒體內(nèi)表達(dá)，結(jié)果顯示在乏氧培養(yǎng)條件下，食管癌細(xì)胞中TIGAR在線粒體中的表達(dá)升高（圖2）。

2.3 研究調(diào)控TIGAR線粒體定位對(duì)乏氧食管癌細(xì)胞輻射敏感性的影響

圖1 WB 檢測不同食管癌細(xì)胞中TIGAR 在線粒體及全細(xì)胞中的表達(dá)量

包裝慢病毒，在KYSE410細(xì)胞中敲除TIGAR以及在KYSE450細(xì)胞中過表達(dá)TIGAR。結(jié)果顯示敲除TIGA降低了TIGAR的線粒體定位水平（圖3A）；而過表達(dá)TIGAR提高了TIGAR的線粒體定位水平（圖3B）。克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示在干擾KYSE410細(xì)胞TIGAR表達(dá)后，細(xì)胞在乏氧條件下的輻射敏感性增加（圖3C）。而在KYSE450細(xì)胞過表達(dá)TIGAR后，細(xì)胞在乏氧條件下輻射敏感性降低（圖3D）。

圖2 WB 檢測TIGAR 在乏氧條件下線粒體及全細(xì)胞中的表達(dá)量

圖3 A、B WB 檢測干擾及過表達(dá)TIGAR 后其線粒體定位水平的變化；C、D 克隆形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證在調(diào)控TIGAR 后，細(xì)胞在乏氧條件下輻射敏感性的變化

3 討論

食管癌是全球較常見惡性腫瘤之一。在我國，其發(fā)病率和癌癥死亡率均居我國消化道腫瘤第2位[1]。作為目前的研究熱點(diǎn)，腫瘤微環(huán)境被發(fā)現(xiàn)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及治療抵抗的過程中都發(fā)揮著重要作用。研究顯示大多數(shù)實(shí)體瘤能產(chǎn)生乏氧區(qū)域，而乏氧可以造成腫瘤對(duì)放射治療產(chǎn)生抵抗[4]。目前關(guān)于如何克服腫瘤乏氧輻射抵抗，仍沒有很好的方法。我們的研究圍繞食管癌乏氧輻射抵抗展開，揭示了食管癌乏氧輻射抵抗的新機(jī)制，為臨床克服食管癌乏氧輻射抵抗提供了新思路及相關(guān)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

TIGAR受P53誘導(dǎo)，TIGAR能促進(jìn)細(xì)胞的氧化磷酸化，最終導(dǎo)致細(xì)胞中ROS產(chǎn)生減少。已發(fā)現(xiàn)TIGAR在多種腫瘤組織高表達(dá)的現(xiàn)象.提示了TIGAR與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在著緊密的聯(lián)系[10-11]。

我們?cè)诒卷?xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)乏氧情況下TIGAR在線粒體中的定位增高。其機(jī)制目前尚不明確。研究顯示乏氧條件下TIGAR的線粒體定位依賴于乏氧誘導(dǎo)因子1α的激活[12]。因此我們考慮食管癌乏氧介導(dǎo)的TIGAR的線粒體定位，也可能位依賴于乏氧誘導(dǎo)因子1α等關(guān)鍵因子及信號(hào)通路的激活。

TIGAR與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，本研究通過干預(yù)TIGAR 線粒體定位逆轉(zhuǎn)乏氧食管癌細(xì)胞的輻射抗性，進(jìn)一步為食管癌放療增敏提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究顯示乏氧可以誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞中的TIGAR線粒體定位，從而介導(dǎo)食管癌乏氧輻射抵抗。