鐵蓄積對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松家兔骨代謝生化指標(biāo)表達(dá)的影響

鄺立鵬　譚偉源　陳軍平　姚澤明　何勇檳

【摘要】 目的 探討鐵蓄積狀態(tài)對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松家兔骨代謝生化指標(biāo)表達(dá)的影響。方法 30只8月

齡新西蘭家兔， 隨機(jī)分為對(duì)照組、去勢(shì)組、鐵蓄積去勢(shì)組， 每組10只。去勢(shì)組和鐵蓄積去勢(shì)組兔均行卵巢切除術(shù)， 鐵蓄積去勢(shì)組在卵巢切除后耳緣靜脈注射蔗糖鐵造模。比較三組兔造模后不同時(shí)間腰椎及右股骨骨密度（BMD）及兔骨代謝指標(biāo)水平。結(jié)果 造模后20周， 鐵蓄積去勢(shì)組兔腰椎及右股骨BMD明顯低于對(duì)照組及去勢(shì)組， 去勢(shì)組兔腰椎及右股骨BMD明顯低于對(duì)照組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。造模后12、20周， 去勢(shì)組、鐵蓄積去勢(shì)組兔血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRAP-5b）水平明顯高于對(duì)照組， 血清骨堿性磷酸酶（BALP）水平低于對(duì)照組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;鐵蓄積去勢(shì)組兔血清TRAP-5b水平（9.17±0.48）、（11.45±0.32）U/L明顯高于去勢(shì)組的（7.04±0.40）、（8.56±0.17）U/L， 血清BALP水平（18.87±1.72）、（15.16±0.72）U/L低于去勢(shì)組的（22.62±1.63）、（19.72±0.43）U/L， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。造模后12、20周， 去勢(shì)組、鐵蓄積去勢(shì)組兔血清核因子κB受體活化因子配體（RANKL）水平高于對(duì)照組， 鐵蓄積去勢(shì)組兔血清RANKL水平高于去勢(shì)組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 鐵

蓄積狀態(tài)可進(jìn)一步上調(diào)去勢(shì)骨質(zhì)疏松大鼠血清TRAP-5b及RANKL的表達(dá)， 下調(diào)血清BALP的表達(dá)， 從而加強(qiáng)骨吸收、減弱骨生成， 導(dǎo)致骨質(zhì)疏松加重。

【關(guān)鍵詞】 鐵蓄積;去勢(shì);骨質(zhì)疏松;骨代謝

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.20.103

Influence of iron accumulation on biochemical indicators of bone metabolism in ovariectomized osteoporosis rabbits? ?KUANG Li-peng， TAN Wei-yuan， CHEN Jun-ping， et al. Department of Orthopaedics， Fifth Affiliated Hospital of Zunyi Medical University， Zhuhai 519100， China

【Abstract】 Objective? ?To discuss the influence of iron accumulation on biochemical indicators of bone metabolism in castration osteoporosis rabbits. Methods? ?A total of 30 8-month-old New Zealand rabbits were randomly divided into control group， castration group and iron accumulation castration group， with 10 rabbits in each group. Castration group and iron accumulation castration group received ovariectomy， and the iron accumulation castration group was injected with sucrose iron after ovariectomy. Bone mineral density （BMD） of lumbar spine and right femur and bone metabolic index of rabbits at different time after model establishment were compared among three groups. Results? ?At 20 weeks after modeling， iron accumulation castration group had obviously lower BMD of lumbar spine and right femur than control group and castration group， and castration group had obviously lower BMD of lumbar spine and right femur than control group. Their difference was statistically significant （P<0.05）. After 12 and 20 weeks of modeling， castration group and iron accumulation castration group had obviously higher serum tartrate-resistant acid phosphatase 5b （TRAP-5b） than control group， and lower serum bone alkaline phosphatase （BALP） than control group. Their difference was statistically significant （P<0.05）. Iron accumulation castration group had obviously higher serum TRAP-5b as （9.17±0.48） and （11.45±0.32） U/L than （7.04±0.40） and （8.56±0.17） U/L in castration group， and lower serum BALP as （18.87±1.72） and （15.16±0.72） U/L than （22.62±1.63） and （19.72±0.43） U/L in castration group. Their difference was statistically significant （P<0.05）. After 12 and 20 weeks of modeling， castration group and iron accumulation castration group had higher serum receptor-activator of nuclear factor κ B ligand （RANKL） than the control group， and iron accumulation castration group had higher serum RANKL than castration group. Their difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion? ?Iron accumulation can further up-regulate the expression of TRAP-5b and RANKL in serum and down-regulate the expression of BALP in serum of ovariectomized osteoporotic rats， thereby enhancing bone resorption and weakening bone formation， leading to the aggravation of osteoporosis.

【Key words】 Iron accumulation; Castration; Osteoporosis; Bone metabolism

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis， PMOP） 是指女性絕經(jīng)后出現(xiàn)卵巢內(nèi)分泌功能衰退， 雌激素水平下降， 從而導(dǎo)致骨量減少的一種代謝性疾病[1]。該病發(fā)病率較高[2]， 是老年女性胸腰椎骨折發(fā)病的主要原因[3]， 對(duì)老年女性的生活產(chǎn)生重大的影響[4]。有研究表明， 人體鐵蓄積狀態(tài)可能與絕經(jīng)后女性骨密度（bone mineral density， BMD）降低密切相關(guān)[5]。本研究于2017年6月～2018年11月觀察了鐵蓄積對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松家兔骨代謝生化指標(biāo)表達(dá)的影響， 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料來(lái)源 動(dòng)物：30只8月齡新西蘭大白兔， 雌性， 體重2.3～2.5 kg， 購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 許可證號(hào)：[SCXK（粵）2014-0035]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分籠飼養(yǎng)， 自由進(jìn)食、飲水。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25℃， 相對(duì)濕度為40%～70%。主要試劑：兔血清BALP 酶聯(lián)免疫吸附劑試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（武漢貝茵萊生物科技有限公司）、兔血清TRAP-5b ELISA試劑盒（武漢貝茵萊生物科技有限公司）、兔血清RANKL ELISA試劑盒（武漢貝茵萊生物科技有限公司）、蔗糖鐵注射液（廣東天普生化醫(yī)藥有限公司）。主要儀器：雙能X線骨密度儀（OSTEOCORE， 法國(guó)MEDILINK）， 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Multiskan Go， 賽默飛世爾科技有限公司）。將30只雌性8月齡新西蘭家兔隨機(jī)分為對(duì)照組、去勢(shì)組、鐵蓄積去勢(shì)組， 每組10只。

1. 2 兔鐵蓄積狀態(tài)骨質(zhì)疏松模型的建立

1. 2. 1 卵巢切除術(shù) 去勢(shì)組和鐵蓄積去勢(shì)組以10%水合氯醛按1.5 ml/kg劑量經(jīng)耳緣靜脈注射充分麻醉， 消毒、鋪無(wú)菌巾， 于兔腹正中恥骨聯(lián)合上方作一長(zhǎng)約9 cm切口， 打開腹腔， 去勢(shì)組和鐵蓄積去勢(shì)組切除雙側(cè)卵巢， 關(guān)閉腹腔縫合切口;對(duì)照組打開腹腔找到卵巢后即關(guān)閉腹腔縫合切口。術(shù)后3 d內(nèi)肌內(nèi)注射慶大霉素1萬(wàn)U/kg， 2次/d。術(shù)后各兔自由進(jìn)食、飲水。

1. 2. 2 注射蔗糖鐵 鐵蓄積去勢(shì)組于卵巢切除術(shù)后1周經(jīng)耳緣靜脈注射蔗糖鐵， 劑量為15 mg/kg， 1次/周， 共12周建立兔鐵蓄積狀態(tài)骨質(zhì)疏松模型， 同時(shí)對(duì)照組與去勢(shì)組以相同頻次經(jīng)耳緣靜脈注射等量生理鹽水。

1. 3 觀察指標(biāo) 比較三組兔造模后不同時(shí)間腰椎、右股骨BMD及兔骨代謝指標(biāo)水平。

1. 3. 1 兔骨代謝指標(biāo)測(cè)定 三組兔分別于造模后4、12、20周經(jīng)耳緣靜脈取血5 ml， 置于離心機(jī)中， 5000 r/min 離心5 min， 收集血清。采用ELISA測(cè)定血清TRAP-5b、BALP、RANKL水平， 具體方法參見(jiàn)相應(yīng)的試劑盒說(shuō)明書。

1. 3. 2 兔腰椎及右股骨BMD檢測(cè) 于造模后4、12、20周， 三組兔分別予10%水合氯醛按1.5 ml/kg劑量經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉后， 俯臥位置于雙能X線骨密度儀上， 將兔四足充分伸展， 采用雙能X線骨密度儀小動(dòng)物模式對(duì)各兔進(jìn)行掃描， 檢測(cè)各兔腰3～5椎及右側(cè)股骨BMD情況。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)， 多組比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 造模后實(shí)驗(yàn)兔一般情況 三組兔術(shù)后3 d活動(dòng)較少， 進(jìn)食飲水量減少， 考慮與術(shù)后切口疼痛有關(guān)。三組兔于術(shù)后第4天均可正常飲食， 活動(dòng)恢復(fù)正常。三組兔術(shù)后切口均愈合良好， 無(wú)紅腫、皮溫高等表現(xiàn)， 無(wú)兔出現(xiàn)死亡， 所有實(shí)驗(yàn)兔于術(shù)后1周拆除縫線。鐵蓄積去勢(shì)組各兔注射蔗糖鐵后飲食二便、活動(dòng)無(wú)異常， 無(wú)兔出現(xiàn)死亡。

2. 2 三組兔造模后不同時(shí)間腰椎及右股骨BMD比較 造模后4、12周， 三組兔腰椎及右股骨BMD比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。造模后12周， 三組兔腰椎及右股骨BMD與本組造模后4周比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。造模后20周，?去勢(shì)組、鐵蓄積去勢(shì)組兔腰椎及右股骨BMD低于本組造模后12周， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。造模后20周， 鐵蓄積去勢(shì)組兔腰椎及右股骨BMD明顯低于對(duì)照組及去勢(shì)組， 去勢(shì)組兔腰椎及右股骨BMD明顯低于對(duì)照組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2. 3 三組兔造模后不同時(shí)間血清TRAP-5b、BALP水平比較 造模后4周， 三組兔血清TRAP-5b、BALP水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;造模后12、20周， 去勢(shì)組、鐵蓄積去勢(shì)組兔血清TRAP-5b水平明顯高于對(duì)照組、血清BALP水平低于對(duì)照組， 鐵蓄積去勢(shì)組兔血清TRAP-5b水平明顯高于去勢(shì)組、血清BALP水平低于去勢(shì)組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2. 4 三組兔造模后不同時(shí)間血清RANKL水平比較 造模后4周， 三組兔血清RANKL水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;造模后12、20周， 去勢(shì)組、鐵蓄積去勢(shì)組兔血清RANKL水平高于對(duì)照組， 鐵蓄積去勢(shì)組兔血清RANKL水平高于去勢(shì)組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3。

3 討論

PMOP是臨床常見(jiàn)的骨質(zhì)疏松[6]， 多發(fā)病于絕經(jīng)后5～10年的老年女性[1]， 是老年女性易發(fā)生胸腰椎及腕部骨折的主要原因[2]。目前有研究指出， 女性在絕經(jīng)后會(huì)出現(xiàn)鐵蓄積狀態(tài)， 這主要與絕經(jīng)后女性體內(nèi)轉(zhuǎn)鐵蛋白表達(dá)下降有關(guān) [7]。而有研究表明， 體內(nèi)鐵蓄積狀態(tài)與女性絕經(jīng)后BMD下降有重要關(guān)聯(lián)[8]。更有學(xué)者指出鐵蓄積可能是骨質(zhì)疏松發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[9]。因此， 明確鐵蓄積狀態(tài)對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松BMD的影響， 可有望尋求有效的防治PMOP的療法。

本研究采用去勢(shì)聯(lián)合注射蔗糖鐵的方法成功建立兔鐵蓄積去勢(shì)骨質(zhì)疏松模型， 從研究結(jié)果可得， 造模后4、12周， 三組兔腰椎及右股骨BMD比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。造模后20周， 鐵蓄積去勢(shì)組兔腰椎及右股骨BMD明顯低于對(duì)照組及去勢(shì)組， 去勢(shì)組兔腰椎及右股骨BMD明顯低于對(duì)照組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。由此可推測(cè)， 鐵蓄積可致去勢(shì)骨質(zhì)疏松家兔骨量丟失更為嚴(yán)重。但鐵蓄積狀態(tài)如何加重絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松骨量的丟失， 目前其機(jī)制尚未完全明確[10]。

本實(shí)驗(yàn)從鐵蓄積狀態(tài)與骨代謝生化指標(biāo)表達(dá)相關(guān)性入手， 嘗試探討鐵蓄積狀態(tài)加重絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)常用于檢測(cè)的骨代謝生化指標(biāo)較多， 如甲狀旁腺激素（PTH）、TRAP-5b、BALP、Ⅰ型前膠原氨基端前肽（PINP）、RANKL等[11]。本研究在造模后4、12、20周檢測(cè)三組兔血清骨代謝生化指標(biāo)TRAP-5b、BALP、RANKL的表達(dá)， 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得， 造模后12、20周， 去勢(shì)組、鐵蓄積去勢(shì)組兔血清TRAP-5b水平明顯高于對(duì)照組、血清BALP水平低于對(duì)照組， 鐵蓄積去勢(shì)組兔血清TRAP-5b水平明顯高于去勢(shì)組、血清BALP水平低于去勢(shì)組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

造模后12、20周， 去勢(shì)組、鐵蓄積去勢(shì)組兔血清RANKL水平高于對(duì)照組， 鐵蓄積去勢(shì)組兔血清RANKL水平高于去勢(shì)組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。說(shuō)明自造模12周起， 去勢(shì)組與鐵蓄積去勢(shì)組骨代謝生化指標(biāo)表達(dá)與對(duì)照組比較有明顯差異， 并隨造模時(shí)間增長(zhǎng)差異更為明顯。而與去勢(shì)組比較， 鐵蓄積去勢(shì)組兔血清BALP下降與RANKL、TRAP-5b上升最為顯著。TRAP-5b與BALP分別為破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分泌的蛋白[12]， 兩者的表達(dá)水平分別反映骨吸收與骨形成的情況[13]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可推測(cè)， 鐵蓄積狀態(tài)在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松基礎(chǔ)上可能進(jìn)一步下調(diào)BALP及上調(diào)TRAP-5b的表達(dá)， 從而減弱成骨細(xì)胞活性、加強(qiáng)破骨細(xì)胞活性， 從而促進(jìn)骨吸收、減少骨生成， 導(dǎo)致骨量進(jìn)一步丟失。

骨保護(hù)素（OPG）/核因子κ B受體活化因子（RANK）/RANKL系統(tǒng)在骨代謝調(diào)節(jié)的動(dòng)態(tài)平衡中起重要作用[14]， 該系統(tǒng)多用于骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制的研究[15]， 而RANKL是該系統(tǒng)重要的受體活化因子[16]， 主要調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化與成熟[17]， 對(duì)骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)起重要作用[18]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知， 鐵蓄積去勢(shì)組RANKL表達(dá)水平會(huì)較單純?nèi)?shì)組上升明顯， 可推測(cè)鐵蓄積可能在下調(diào)BALP及上調(diào)TRAP-5b表達(dá)的同時(shí)， 調(diào)RANKL的表達(dá)， 導(dǎo)致OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡被打破， 促進(jìn)破骨細(xì)胞分化成熟， 使骨吸收增加， 引起骨質(zhì)疏松加重。

從研究結(jié)果可得， 在造模后12周起去勢(shì)組與鐵蓄積去勢(shì)組兔骨代謝生化指標(biāo)已出現(xiàn)明顯改變， 而在造模后20周才出現(xiàn)BMD的改變， 骨代謝生化指標(biāo)可早期反映鐵蓄積去勢(shì)組兔骨質(zhì)情況， 對(duì)于早期防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松有指導(dǎo)意義。

綜上所述， 鐵蓄積狀態(tài)可進(jìn)一步上調(diào)去勢(shì)骨質(zhì)疏松大鼠血清TRAP-5b及RANKL的表達(dá)， 下調(diào)血清BALP的表達(dá)， 從而加強(qiáng)骨吸收、減弱骨生成， 引起骨質(zhì)疏松加重。

參考文獻(xiàn)

[1] Chen P， Li Z， Hu Y. Prevalence of osteoporosis in China： a meta-analysis and systematic review. BMC Public Health， 2016， 16（1）：1039.

[2] Lupsa BC， Insogna K. Bone health and osteoporosis. Endocrinol Metab Clin North Am， 2015， 44（3）：517-530.

[3] Nakatoh S， Takemaru Y. Application of the fracture risk assessment tool and determination of suitable cut-off values during primary screening in specific health check-ups in Japan. J Bone Miner Metab， 2013， 31（6）：674-680.

[4] Yilmaz M， Isaoglu U， Uslu T， et al. Effect of methylprednisolone on bone mineral density in rats with ovariectomy-induced bone loss and suppressed endogenous adrenaline levels by metyrosine. Indian J Pharmacol， 2013， 45（4）：344-347.

[5] 趙國(guó)陽(yáng)， 狄東華， 莊琴， 等. 輸血相關(guān)鐵蓄積患者骨密度分析. 中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志， 2016， 22（12）：1568-1572.

[6] 智信， 陳曉， 蘇佳燦. 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展. 中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志， 2018， 24（11）：1510-1513， 2534.

[7] 趙國(guó)陽(yáng)， 程千， 張偉， 等. 絕經(jīng)后脆性骨折患者血清轉(zhuǎn)鐵蛋白與骨代謝指標(biāo)的關(guān)系. 江蘇醫(yī)藥， 2015， 41（22）：2665-2666， 2669.

[8] Dunn IF， Bi WL， Erkmen K， et al. Medial acoustic neuromas：clinical and surgical implications. J Neurosurg， 2014， 120（5）：1095-1104.

[9] 單宇， 王亮， 張敏， 等. 鐵蓄積、骨內(nèi)血管與骨質(zhì)疏松關(guān)系的研究進(jìn)展. 中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志， 2017， 23（7）：954-957， 962.

[10] Xiao W， Beibei F， Guangsi S， et al. Iron overload increases osteoclastogenesis and aggravates the effects of ovariectomy on bone mass. J Endocrinol， 2015， 226（3）：121-134.

[11] Iki M， Fujita Y， Tamaki J， et al. Trabecular bone score may improve FRAX? prediction accuracy for major osteoporotic fractures in elderly Japanese men： the Fujiwara-kyo Osteoporosis Risk in Men （FORMEN） Cohort Study. Osteoporos Int， 2015， 26（6）：1841-1848.

[12] 吳顯勁， 梁棟偉， 李秋麗， 等. 骨代謝生化指標(biāo)測(cè)定在老年人骨質(zhì)疏松癥中的應(yīng)用. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志， 2014， 24（11）：1604-1605， 1608.

[13] Zheng X， Wu G， Nie Y， et al. Electroacupuncture at the governor vessel and bladder meridian acupoints improves postmenopausal osteoporosis through osteoprotegerin/RANKL/RANK and Wnt/β-catenin signaling pathways. Exp Ther Med， 2015， 10（2）：541-548.

[14] 呂建敏， 陳方明， 陳誠(chéng). 基于OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)比較研究前肢畸形WHBE兔骨代謝特征. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)， 2016， 24（5）：503-510.

[15] 陳瀚宇， 徐穎鵬， 李鼎鵬， 等. RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)在骨性關(guān)節(jié)炎與骨質(zhì)疏松相關(guān)性中的作用機(jī)制. 中國(guó)中醫(yī)骨傷科雜志， 2019， 27（1）：86-88.

[16] Kharroubi A， Saba E， Smoom R， et al. Serum 25-hydroxyvitamin D and bone turnover markers in Palestinian postmenopausal osteoporosis and normal women. Arch Osteoporos， 2017， 12（1）：13-21.

[17] Liu Y， Ge JP， Chen DY， et al. Osteoprotegerin deficiency leads to deformation of the articular cartilage in femoral head. Journal of Molecular Histology， 2016， 47（5）： 1516-1522.

[18] Liu Y， Du HM， Wang YF， et al. Osteoprotegerin-Knockout Mice Developed Early Onset Root Resorption. Journal of Endodontics， 2016， 42（10）：1516-1522.

[收稿日期：2019-02-26]