東海鼠尾藻巖藻黃質含量的高效液相色譜法測定

高捷 沃聯群 王銀羽 李成平

[摘要] 目的 建立東海鼠尾藻巖藻黃質含量測定的高效液相色譜法。 方法 選用美國賽分Welch C18色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm），進樣量20 μL，流動相用乙酸乙酯和90%甲醇水溶液梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，波長為450 nm，柱溫：室溫。 結果 方法的線性范圍為2.7～43.2 μg/mL（r = 0.9997），檢出限（3S/N）為0.027 μg/mL，定量限（10S/N）為0.086 μg/mL。回收率在99.6%～105.0%之間，RSD為1.78%（n = 9）。 結論 該方法簡便靈敏，其結果準確可靠，可用于巖藻黃質的質量控制。

[關鍵詞] 高效液相色譜法;巖藻黃質;鼠尾藻

[中圖分類號] R917.101? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）07（a）-0039-04

High performance liquid chromatography determination of fucoxanthin content in Sargassum thunbergii of the East China Sea

GAO Jie1? ?WO Lianqun1? ?WANG Yinyu2? ?LI Chengping2，3

1.Zhejiang Pharmaceutical College， Zhejiang Province， Ningbo? ?315100， China; 2.College of Pharmaceutical Science， Zhejiang University of Technology， Zhejiang Province， Hangzhou? ?310032， China; 3.College of Biology and Environment Engineering， Zhejiang Shuren University， Zhejiang Province， Hangzhou? ?310015， China

[Abstract] Objective To establish an high performance liquid chromatography method for the determination of fucoxanthin content in Sargassum thunbergii of the East China Sea. Methods The samples （20 L） were separated on a Sepax Welch C18 column （4.6 mm×250.0 mm， 5 μm） with a gradient elution of ethyl acetate and 90% aqueous methanol at a flow rate of 1.0 mL/min and detected at 450 nm. The column temperature was kept at room temperature. Results A good linearity was obtained in the test range of 2.7-43.2 μg/mL （r = 0.9997）. The limit of detection （3S/N） was 0.027 μg/mL and the limit of quantitation （10S/N） was 0.086 μg/mL. The average recoveries of fucoxanthin were between 99.6% and 105.0%， with a RSD of 1.78% （n = 9）. Conclusion The method is simple， sensitive， accurate， and can be used for the quality control of fucoxanthin.

[Key words] High performance liquid chromatography; Fucoxanthin; Sargassum thunbergii

巖藻黃質化學名為3′-（乙酰氧基）-6′，7′-二脫氫-5，6-環氧-5，5′，6，6′，7，8-六氫-3，5′-二羥基-8-氧代-β，β-胡蘿卜素，分子式：C42H58O6，研究表明巖藻黃質具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、降血糖、降血脂及減肥等多種生物活性[1-9]。巖藻黃質己成為當前海洋藥物探索與開發的熱點之一。

現國內與國外關于巖藻黃質的研究大多取材于海帶、裙帶菜和羊棲菜等[10-14]，以鼠尾藻為材料提取巖藻黃質的研究最近才有報道[15-16]。海帶、裙帶菜等大型藻類生長速率慢，巖藻黃質含量低，需要較長時間和相對高的成本才能獲得足夠提取量。東海富生鼠尾藻[Sargassum thunbergii（Mert.）O′Kuntze]，屬于褐藻門、圓子綱、墨角藻目、馬尾藻科、馬尾藻屬，富含巖藻黃質[15，17-18]。為了配合筆者所在團隊進行的“東海鼠尾藻中巖藻黃質的提取工藝研究和抗更年期肥胖活性評價”項目研究，本試驗參照文獻[19-20]建立了東海鼠尾藻中巖藻黃質含量測定的高效液相色譜法。經方法學試驗，該方法簡便靈敏、可行，可用于本品的質量控制。

1 儀器與試藥

高效液相色譜系統（P230Ⅱ高壓恒流泵、UV230Ⅱ紫外-可見檢測器、LU230Ⅱ低壓梯度混合器，大連依利特分析儀器有限公司）;快速溶劑萃取儀（Dionex ASE 200）;旋轉蒸發儀（RE-3000，上海亞榮生化儀器廠）;電子天平（AB 204-N，瑞士梅特勒-托利多公司）;高速離心機（Biofuge Primo R，上海科峻儀器公司）等。

甲醇（分析純，天津四友）;乙醇（分析純，天津四友）;甲醇（色譜純，美國天地）;乙醇（色譜純，美國天地）;乙酸乙酯（色譜純，美國天地）;鼠尾藻試驗樣品（產地：溫州）;巖藻黃質對照品（BOC Sciences批號：20131010）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜分離柱：C18柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm），美國賽分Welch;流動相A：水-甲醇（1∶9，V/V）;流動相B：乙酸乙酯;線性梯度洗脫：B在20 min內由0增至100%;流速1.0 mL/min;柱溫：室溫;波長450 nm，進樣量20 μL。在該色譜條件下，樣品及對照色譜圖見圖1。

2.2 線性關系

精密稱取巖藻黃質對照品10.8 mg，于10 mL容量瓶中，用無水乙醇超聲溶解并定容至刻度，搖勻，得到濃度為1.08 mg/mL巖藻黃質對照品儲備液，于4℃下避光低溫貯存。

精密吸取一定量的對照品儲備液并用流動相逐步稀釋至2.7、5.4、10.8、21.6、43.2 μg/mL的對照品系列工作液，按“2.1”色譜條件，分別進樣，以峰面積為縱坐標對溶液質量濃度進行線性回歸，得回歸方程為：A = 78.167C + 106.94，R = 0.9997。說明巖藻黃質在2.7～43.2 μg/mL濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系。檢出限（3S/N）為0.027 μg/mL，定量限（10S/N）為0.086 μg/mL。

2.3 精密度試驗

精密吸取對照品溶液（10.8 μg/mL），按“2.1”色譜條件測定，重復進樣5次，測定巖藻黃質峰面積，分別為954.47、965.13、945.30、952.54、957.73;計算得RSD為0.76%，表明儀器性能良好，該方法精密度較高。

2.4 重現性試驗

精密稱取同一批鼠尾藻6份，每份5 g，制成樣品溶液，分別依次按“2.1”色譜條件測定。測得巖藻黃質的峰面積，得出鼠尾藻樣品中巖藻黃質提取率分別為6.764、6.794、6.808、6.736、7.108、6.972 μg/g，計算得RSD為2.11%，表明該方法提取重現性良好。

2.5 加樣回收率

按“2.1”色譜條件，精密稱取已測知含量的巖藻黃質樣品共9份，各置于100 mL容量瓶中，加該樣品量的80%、100%、120%的巖藻黃質對照品，用流動相溶解后稀釋到刻度，進樣20 μL，依法測定，分別記錄色譜圖。實驗結果見表1。

2.6 樣品含量測定

取一定量的鼠尾藻，洗凈、干燥、粉碎后，過60目篩，放在-20℃冰箱里避光備用。精確稱取一定量的鼠尾藻粉末置于燒杯中，加入95%乙醇，搖勻，封口，置于60℃的超聲波清洗器中，超聲提取30 min，取出，放置室溫下冷卻。將提取液過濾，在旋轉蒸發儀中40℃的條件下旋蒸濃縮至10 mL。取樣1 mL置于離心管中，在高速離心機中離心5 min，取上清液，過0.45 μm膜的濾液作樣品溶液。另取巖藻黃質對照品，加流動相制成10.8 μg/mL的溶液作對照溶液，按“2.1”色譜條件，分別進樣20 μL，按外標法計算巖藻黃質提取率為3.72 μg/g。

2.7 分離專屬性

吸取43.2 μg/mL的巖藻黃質1 mL，共5份，分別經100℃加熱3 h，0.1 mol/L酸或堿、3%過氧化氫60℃恒溫處理2 h，陽光直射0.5 h。取樣測定，記錄色譜圖。結果表明，巖藻黃質對酸、堿、氧化劑、高溫及光照均不穩定，尤其酸呈現100%的破壞率。在“2.1”色譜條件下，巖藻黃質峰與酸、堿、高溫、氧化及光照降解產物均能很好地分離（圖2）。

3 討論

3.1 液相色譜梯度洗脫的優點

在巖藻黃質提取工藝研究中，巖藻黃質含量測定較多采用分光光度法[12-14，16]。而海帶等海藻類是自養生物，除了含有巖藻黃質之外，還具有維持光合作用所必需的葉綠素等。葉綠素在400～500 nm范圍內有較強吸收。使用有機試劑萃取時，巖藻黃質將與葉綠素一并萃取出來。用分光光度法測定時，葉綠素對巖藻黃質的分析產生干擾[19]。

巖藻黃質含量測定的高效液相色譜法較多采用流動相等度洗脫[15，20]，本研究根據參考文獻[19]改進，對流動相所用的比例進行系列試驗，結果表明加入乙酸乙酯，選用梯度洗脫，巖藻黃質的峰形得到較大改善，峰高變高，半峰寬減小，峰形較為對稱，水-甲醇=10∶90時峰形為最佳。相對于參考文獻[19]采用乙腈/水流動相更經濟和環保。

3.2 不同條件對巖藻黃質的影響

本研究在對巖藻黃質的破壞性實驗中發現，巖藻黃質其實很不穩定，非常容易分解，且對酸、堿、氧化劑、高溫及光照均不穩定，其貯存條件對環境的要求很苛刻，在實驗中要注意避光和低溫操作。

實驗表明，用高效液相色譜法對東海鼠尾藻中的巖藻黃質含量進行測定，快速、簡便、靈敏，重現性好，可用于鼠尾藻中巖藻黃質含量的質量控制。

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