基于代謝組學(xué)技術(shù)的清開靈軟膠囊解熱作用機(jī)制研究

鄭蕊 杜守穎 劉宇 郭瑞

[摘要] 目的 基于代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)清開靈軟膠囊的解熱作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，探討與其相關(guān)的作用機(jī)制。 方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將18只SD雄性大鼠分為對(duì)照組、模型組和給藥組，每組6只。模型組和給藥組采用干酵母造模;給藥組給予清開靈軟膠囊內(nèi)容物的0.5%羧甲基纖維素鈉混懸液，以黃芩苷計(jì)12.5 mg/kg;模型組和對(duì)照組等體積灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉。應(yīng)用超高效液相色譜-線性離子阱/靜電場(chǎng)軌道阱結(jié)合高分辨質(zhì)譜法（UPLC-LTQ/Orbitrap-MS）的代謝組學(xué)技術(shù)，在正、負(fù)離子模式下對(duì)大鼠血漿進(jìn)行代謝輪廓分析。借助多元變量統(tǒng)計(jì)分析對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，尋找血漿中與發(fā)熱相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，探究清開靈軟膠囊對(duì)這些內(nèi)源性成分的逆向調(diào)節(jié)作用，推斷其可能的代謝通路。 結(jié)果 在主成分分析（PCA）圖上，對(duì)照組、模型組和給藥組血漿代謝物譜明顯分離，發(fā)現(xiàn)并鑒定出8種潛在的血漿生物標(biāo)志物，分別為乳酸、煙酸、3-呋喃甲酸、琥珀酸、磷脂酰膽堿、花生四烯酸、LysoPE[0∶0/22∶4（7Z，10Z，13Z，16Z）]、油酸;與對(duì)照組比較，模型組大鼠血漿中乳酸（P < 0.01）、煙酸（P < 0.01）、3-呋喃甲酸（P < 0.01）、琥珀酸（P < 0.01）含量顯著升高，磷脂酰膽堿（P < 0.05）、花生四烯酸（P < 0.01）、LysoPE[0∶0/22∶4（7Z，10Z，13Z，16Z）]（P < 0.01）、油酸（P < 0.05）含量顯著降低。給藥組大鼠血漿中8種生物標(biāo)志物含量均顯著回調(diào)（P < 0.01或P < 0.05）。 結(jié)論 代謝組學(xué)方法可用于清開靈軟膠囊的療效評(píng)價(jià)，其可能通過調(diào)節(jié)體內(nèi)能量代謝和磷脂類代謝發(fā)揮解熱作用。

[關(guān)鍵詞] 清開靈;軟膠囊;代謝組學(xué);超高效液相色譜-線性離子阱/靜電場(chǎng)軌道阱結(jié)合高分辨質(zhì)譜法

[中圖分類號(hào)] R285? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）07（a）-0034-05

Study on antipyretic mechanism of Qingkailing Soft Capsules based on metabonomics

ZHENG Rui1，2? ?DU Shouying1，3? ?LIU Yu2? ?GUO Rui4

1.Traditional Chinese Pharmacy， Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin? ?300193， China; 2.Laboratory of Traditional Chinese Medicine Preparation， Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing? ?100091， China; 3.Traditional Chinese Pharmacy， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing? ?100029， China; 4.Clinical Medical College， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing? ?100029， China

[Abstract] Objective To evaluate the antipyretic effect of Qingkailing Soft Capsules based on metabonomics technology and to explore its related mechanism. Methods A total of 18 SD male rats were randomly divided into control group， model group and administration group， with 6 rats in each group. Model group and administration group were feverished by dry yeast. Rats in the administration group were given 0.5% CMC-Na suspension of Qingkailing Soft Capsules with baicalin as 12.5 mg/kg and model group and blank group were intragastrically administered with 0.5% CMC-Na at the same volume. The metabolic profiles of rat plasma were analyzed under positive and negative ion modes by ultra-performance liquid chromatography-inear ion trap/orbitrap high resolution mass spectrometry （UPLC-LTQ/Orbitrap-MS） metabolomics technique. Through the multivariate statistical analysis method， the data of each group were compared and analyzed， and the potential biomarkers related to fever in plasma were searched. The reverse regulation of Qingkailing Soft Capsules on these endogenous components was explored， and the possible metabolic pathways were inferred. Results On the principal component analysis （PCA） chart， the plasma metabolite profiles of the control group， model group and administration group were separated obviously. Eight potential plasma biomarkers were found and identified， which were lactic acid， nicotinic acid， 3-furoic acid， succinic acid， phosphocholine， arachidonic acid， LysoPE [0∶0/22∶4 （7Z， 10Z， 13Z， 16Z）] and oleic acid. Compared with the control group， the contents of lactic acid （P < 0.01）， nicotinic acid （P < 0.01）， 3-furoic acid （P < 0.05）， succinic acid （P < 0.01） were increased significantly， while the contents of phosphocholine （P < 0.05）， arachidonic acid （P < 0.01）， LysoPE [0∶0/22∶4 （7Z， 10Z， 13Z， 16Z）] （P < 0.01）， oleic acid （P < 0.05） were decreased significantly， which were in the model group. The contents of eight biomarkers in plasma of rats in the administration group were significantly reversed （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Metabonomics can be used to evaluate the efficacy of Qingkailing Soft Capsules， which may play an antipyretic role by regulating energy metabolism and phospholipid metabolism.

[Key words] Qingkailing; Soft capsule; Metabonomics; Ultra-performance liquid chromatography-linear ion trap/ orbitrap high resolution mass spectrometry

清開靈軟膠囊是在安宮牛黃丸基礎(chǔ)上制成的新型中藥制劑，由膽酸、豬去氧膽酸、黃芩苷、金銀花等組成，具有清熱解毒、鎮(zhèn)靜安神的功效，用于上呼吸道感染、病毒性感冒、高熱等病癥，臨床療效確切[1-3]。代謝組學(xué)是通過描述生物體系受外界刺激或擾動(dòng)后其內(nèi)源性代謝物組的變化規(guī)律，揭示生命代謝活動(dòng)的生物學(xué)活動(dòng)本質(zhì)的一門科學(xué)[4]。目前，清開靈制劑代謝組學(xué)的相關(guān)研究多集中于清開靈注射劑[5-6]，而清開靈軟膠囊發(fā)揮整體藥效的作用機(jī)制尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。由于不同的藥物劑型和不同的給藥途徑會(huì)影響藥物有效成分的吸收、分布、代謝、排泄等，從而影響藥物的療效及作用機(jī)制，因此本研究采用超高效液相色譜-線性離子阱/靜電場(chǎng)軌道阱結(jié)合高分辨質(zhì)譜法（UPLC-LTQ/Orbitrap-MS）分析技術(shù)，借助代謝組學(xué)的研究策略，探討清開靈軟膠囊干預(yù)酵母誘導(dǎo)發(fā)熱大鼠的解熱作用機(jī)制，為闡明不同劑型的臨床應(yīng)用特色和優(yōu)勢(shì)，臨床準(zhǔn)確合理用藥提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重（200±20）g，購(gòu)自斯貝福（北京）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司[許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0002]，于動(dòng)物房[溫度：（23±2）℃，濕度（60±5）%]適應(yīng)環(huán)境1周，期間正常進(jìn)食和飲水，12 h白晝黑夜交替。正式試驗(yàn)前，禁食12 h，自由飲水。

1.2 主要儀器與試劑

Thermo液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（美國(guó)賽默飛世爾科技），包括Ultimate 3000高效液相色譜儀，自動(dòng)進(jìn)樣器，DAD檢測(cè)器，柱溫箱，二元泵和LTQ Orbitrap質(zhì)譜，Xcalibur，Metworks和Mass Frontier 7.0用于數(shù)據(jù)采集和處理;TDX-1渦旋混合器（美國(guó)TonDa公司）;D24UV純水器（美國(guó)MilliporeTM公司）。

清開靈軟膠囊（神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：14072411，每粒0.4 g，含黃芩苷20 mg）。高活性干酵母粉（安琪酵母股份有限公司，批號(hào)：20160102W）。乙腈（Merck公司，LC/MS級(jí)）、甲醇（Merck公司，色譜級(jí)）、甲酸（CNW公司，色譜級(jí)）;其他試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與處理

1.3.1 分組及樣本采集? 大鼠置于代謝籠中，適應(yīng)3 d，每天早、中、晚定點(diǎn)對(duì)大鼠實(shí)施適應(yīng)性肛溫測(cè)量，并作為基礎(chǔ)體溫，溫差>0.5℃者剔除。采用隨機(jī)數(shù)字表法將18只體溫合格的大鼠隨機(jī)分為3組，每組6只，分別為對(duì)照組、模型組、給藥組。模型組和給藥組大鼠背部皮下注射20%的干酵母混懸液10 mL/kg，空白組注射等量的生理鹽水。造模4 h時(shí)，給藥組灌胃給予清開靈軟膠囊內(nèi)容物的0.5% CMC-Na混懸液，以黃芩苷計(jì)為12.5 mg/kg;空白組和模型組灌胃等體積的0.5% CMC-Na混懸液。大鼠造模后10 h，用3.5%的水合氯醛（1 mL/kg）腹腔注射迅速麻醉，股動(dòng)脈取血于肝素鈉管中，3000 r/min離心10 min，取上清液并分裝置1.0 mL離心管內(nèi)，-80℃保存待測(cè)。

1.3.2 血漿樣品前處理? 血漿樣品的前處理參照有關(guān)文獻(xiàn)[7-8]并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)確證，血漿樣品4℃解凍，甲醇于4℃預(yù)冷24 h，取血漿100 μL置于1.5 mL離心管中，加入3倍體積的甲醇300 μL，渦旋混合30 s，4℃靜置15 min，以離心半徑8 cm，12 000 r/min離心15 min，取上清液200 μL至進(jìn)樣小瓶。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 色譜條件? 色譜柱：Hyper Gold C18（100 mm×4.6 mm，3 μm）;流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液;梯度洗脫：0～2 min，5%B;2～12 min，5%～95%B;12～15 min，95%B;15～17 min，95%～5%B;流速0.3 mL/min，樣品室溫度保持在4℃，柱溫40℃，進(jìn)樣量4 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件? 離子源為ESI源，正離子檢測(cè)模式，噴霧電壓3.0 kV，離子傳輸管溫度350℃，S-lens電壓30%，離子源溫度300℃，鞘氣流速45 arb，輔助氣流速15 arb，吹掃氣流速1 arb;負(fù)離子檢測(cè)模式，噴霧電壓3.5 kV，離子傳輸管溫度350℃，S-lens電壓60%，離子源溫度300℃，鞘氣流速45 arb，輔助氣流速15 arb，吹掃氣流速1 arb。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIEVE軟件進(jìn)行平滑、去燥， 峰基線校正，再通過Metabo Analyst 3.0完成數(shù)據(jù)預(yù)處理，隨后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 13.0進(jìn)行建模判別分析。通過無監(jiān)督的主成分分析（PCA）和有監(jiān)測(cè)的正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）篩選VIP>1的代謝產(chǎn)物，然后采用SPSS 14.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P < 0.05和VIP>1為潛在的生物標(biāo)志物[9]。

2 結(jié)果

2.1 UPLC-LTQ/Orbitrap-MS檢測(cè)總離子流圖

結(jié)果顯示，無論在正離子模式下，還是負(fù)離子模式下，各組樣品的峰型與數(shù)量都存在差異，但正離子模式下各組峰分離度更好。正、負(fù)離子模式下各組大鼠血漿總離子流圖見圖1。

2.2 多元統(tǒng)計(jì)分析

為進(jìn)一步確定各組間代謝物的差異，首先采用PCA分析法對(duì)對(duì)照組、模型組、給藥組代謝輪廓進(jìn)行分析。對(duì)照組與模型組沿t[2]軸明顯分開，提示酵母誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱模型復(fù)制成功;給藥組位于對(duì)照組與模型組之間，有向?qū)φ战M靠近的趨勢(shì)，提示清開靈軟膠囊能對(duì)大鼠的代謝輪廓回調(diào)。見圖2。