正交設計優選黃芪總黃酮提取工藝

梁泰帥　趙肖瓊　馮美

【摘要】目的：探究黃芪總黃酮提取的最優工藝參數。方法：基于單因素試驗，以黃芪總黃酮提取率為評價指標，通過L9（34）正交試驗法對影響黃芪總黃酮提取率的4個因素（乙醇濃度、水浴溫度、料液比和提取時間）進行考察，優選黃芪總黃酮提取工藝參數。結果：黃芪總黃酮提取的最優工藝參數為乙醇濃度90%、水浴溫度80?℃、料液比1∶12和提取時間2?h，在此條件下，黃芪總黃酮提取率為0.286%。結論：該提取工藝表現出操作簡單、重復性穩定的特點，以期為黃芪資源的合理開發利用提供科學依據。

【關鍵詞】黃芪;總黃酮;正交試驗;提取工藝

【中圖分類號】R285【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2019）9-0030-04

Optimization of Extraction Process of Total Flavonoids from Radix Astragali by Orthogonal Design

LIANG Taishuai1ZHAO Xiaoqiong2FENG Mei1

1.College of Pharmacy， Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China; 2. Department of Environmental and Safety Engineering， Taiyuan Institute of Technology， Taiyuan 030008， China

Abstract：Objective Study on the optimal process parameters for extracting total flavonoids from radix Astragalus. Methods Based on the single factor test， with extraction rate of total flavonoids as indicators and ethanol concentration， water bath temperature， solid-liquid ratio，extraction time as investigated factors， orthogonal array design L9（34） experiments were projected to optimize the extraction process of total flavonoids from radix Astragalus. Results The results showed that the extraction rate of total flavonoids from radix Astragalustragalus was 0.286% with the optimal parameters that the solid-fulid ratio， ethanol concentration， water bath temperature and extracting time were 1∶12?g/mL， 90%， 80?℃ and 2h. Conclusion The extraction process is feasible and stable which provide a scientific basis for the rational development and utilization of astragalus resources.

Key：words：Radix Astragali;Total Flavonoids; OrthogonalTest; Extraction Process

黃芪是山西的一種重要道地藥材，始載于《神農本草經》，味甘、性溫，具有補氣固表、排膿降壓、提高機體免疫力等功效，素有“十藥八芪”之稱[1]。黃酮類化合物是黃芪發揮功效的主要物質基礎和有效部位，可作為抗氧化劑在清除活性氧自由基、抗菌消炎、延緩衰老、抗過敏等方面有著顯著的藥理活性，并已在臨床防治老年高血壓、冠心病和視網膜出血等疾病方面有著廣泛的應用[2-3]。因此，優化黃芪總黃酮的提取工藝對其藥理學作用的深入探究意義重大。本研究分別對乙醇濃度、水浴溫度、料液比和提取時間4個因素進行單因素試驗，確定四因素三水平，設計L9（34）正交試驗，考察黃芪總黃酮提取的最優工藝參數，以期為黃芪資源的合理開發以及臨床應用提供科學依據。

1材料與方法

1.1試藥蒙古黃芪藥材飲片（山西渾源萬生黃芪開發有限公司）;蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-201610）;95%乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉等試劑均為分析純。

1.2儀器電熱鼓風干燥箱（GZX-9070MBE，上海博訊實業有限公司醫療設備廠）;中藥材粉碎機（FW177，天津市泰斯特儀器有限公司）;萬分之一天平（BSA224S-CW，賽多利斯科學儀器北京有限公司）;數顯恒溫水浴鍋（HH-2，國華電器有限公司）;循環水式真空泵[SHZ-D（Ⅲ），上海予申儀器有限公司];紫外可見分光光度計（UV-1200，上海美譜達儀器有限公司）;低速大容量多管離心機（LXJ-IIB，上海安亭科學儀器廠）。

1.3方法

1.3.1蘆丁標準曲線的制作蘆丁標準曲線的制作參照張浩等[3]的方法，稍作改進：準確稱取在105℃干燥至恒重的蘆丁對照品25?mg于100?mL容量瓶中，加70%乙醇定容，得到質量濃度為0.25?mg/mL的蘆丁標準液。分別準確吸取蘆丁標準液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0?mL于7只10?mL容量瓶中，然后分別添加3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5、0?mL的蒸餾水;再向各瓶內添加5%的NaNO2溶液 0.3?mL，混勻并靜置6?min;繼續添加10%的Al（NO3）2溶液 0.3?mL，混勻并靜置6?min;再添加4%的NaOH溶液4?mL，最后用70%的乙醇定容至10?mL，混勻并靜置12?min，依次在510?nm處測定各瓶內反應液的吸光值，以吸光值Y和蘆丁質量濃度X分別作為縱坐標和橫坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程為：Y=0.6804X-0.0012，相關系數R2=0.9998。

1.3.2精密度試驗準確吸取蘆丁標準液1.5?mL于10?mL容量瓶中，按照“1.3.1”項下方法測定吸光值，重復測定6次，計算出RSD為0.481%，表明精密度良好。

1.3.3穩定性試驗供試品溶液制備[4]：將黃芪藥材于60℃烘干至恒重，粉碎后過50目篩。精確稱取黃芪粉末5?g于圓底燒瓶中，加入10倍量90%乙醇，70?℃水浴下回流提取2次，每次2?h，趁熱減壓抽濾2次，合并濾液，5000?r/min離心5?min，上清液即為供試品溶液。

準確吸取供試品溶液1.5?mL于10?mL容量瓶中，按照“1.3.1”項下方法分別于0、15、30、45、60、90、120?min測定吸光值，計算出RSD為1.176%，表明供試品溶液在2?h內穩定。

1.3.4 重復性試驗精確稱取黃芪粉末共6份，按照“1.3.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，各取1.5?mL于10?mL容量瓶中，按照“1.3.1”項下方法測定吸光值，計算出RSD為0.912%，表明此方法重復性較好。

1.3.5加樣回收試驗準確稱取已知含量（5.198?mg/g）的黃芪粉末6份，各約2.5?g，按照“1.3.3”項下方法制備供試品溶液，再分別精確加入適量蘆丁標準液，混勻后按照“1.3.1”項下方法進行測定，計算出平均回收率為99.81%，RSD為0.805%。結果見表1。

1.3.6單因素試驗根據參考文獻和預試驗結果分別設計以下單因素試驗組合：①乙醇濃度為50%、60%、70%、80%和90%，水浴溫度為70?℃，料液比為1∶10，提取時間為2?h;②水浴溫度為60?℃、70?℃、80?℃、90?℃和100?℃，乙醇濃度為90%，料液比為1∶10，提取時間為2?h;③料液比為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12和1∶14，乙醇濃度為90%，水浴溫度為70?℃，提取時間為2?h;④提取時間為1?h、1.5?h、2?h、2.5?h和3?h，乙醇濃度為90%，水浴溫度為70?℃，料液比為1∶10，分別考察以上各試驗條件對黃芪總黃酮提取率的影響。

1.3.7 正交試驗設計依據“1.3.3”項單因素試驗結果，以黃芪總黃酮提取率為考量指標，設計L9（34）正交試驗，選定的正交試驗因素水平見表2。

1.4數據分析分別采用SPSS 18.0和Origin9.0軟件進行正交試驗數據分析檢驗和繪圖。計算公式為[5]：

總黃酮提取率=（C×V）/（M×1000）×100

式中：C表示由標準曲線得到提取液中總黃酮的質量濃度（mg/mL），V表示濾液體積（mL），M表示黃芪粉末質量（g），×1000表示g與mg的單位轉換。

2結果與分析

2.1單因素試驗圖1顯示，隨著乙醇濃度、水浴溫度、料液比和提取時間的增加，黃芪總黃酮的提取率均呈先升高后降低的趨勢，且分別在乙醇濃度為80%、水浴溫度為90?℃、料液比為1∶10和提取時間為2.5?h時，總黃酮提取率達到最大值。因此，選擇乙醇濃度70%、80%和90%，水浴溫度為80?℃、90?℃和100?℃，料液比為1∶8、1∶10和1∶12，提取時間為2?h、2.5?h和3?h進行正交試驗。

2.2正交試驗由表3中R值（極差）可知，對黃芪總黃酮提取率影響的主次因素依次為料液比、乙醇濃度、水浴溫度和提取時間。從表中K1、K2、K3的大小分析得出，黃芪總黃酮的最優提取工藝參數為A3B1C3D1，即乙醇濃度為90%、水浴溫度為80℃、料液比為1∶12、提取時間為2?h。此外，從表4方差分析結果可知，乙醇濃度（P<0.001）、水浴溫度（P<0.01）、料液比（P<0.001）和提取時間（P<0.05）均顯著影響黃芪總黃酮的提取率。

2.3驗證試驗為驗證組合A3B1C3D1為最優提取方案，在此條件下，平行試驗3次，試驗結果見表5，可以看出，在此最優提取條件下，黃芪總黃酮的平均提取率為0.286%，均高于單因素試驗和正交試驗結果，驗證了正交試驗設計優化結果的準確性，表明該提取工藝參數A3B1C3D1（即乙醇濃度為90%、水浴溫度為80℃、料液比為1∶12、提取時間為2?h）合理可行，為黃芪總黃酮最優提取方案。

3討論

相比于微波輔助萃取法、超聲波提取法、超臨界CO2萃取法等，黃酮類物質的乙醇回流提取法操作簡便、效率較高、溶劑可回收、運行成本低，能夠同時兼顧提取效率和工業化生產[4，6]。本試驗選擇乙醇回流提取法進行黃芪總黃酮提取，通過單因素試驗和正交試驗相結合的方法研究乙醇濃度、水浴溫度、料液比和提取時間4個因素對黃芪總黃酮提取率的影響，并通過直觀分析和方差分析綜合考察，確定黃芪總黃酮提取的最優工藝參數[6]。單因素試驗結果發現，黃芪總黃酮提取率均隨乙醇濃度、水浴溫度、料液比和提取時間的增加呈先升高后降低趨勢，表明影響總黃酮提取率的4個因素在選定范圍內均存在顯著最佳值，當各影響因素設定水平高于最佳值時，較高濃度的乙醇溶液使藥材中的低極性雜質易于滲出[5]，造成類黃酮提取效率降低，高溫可破壞類黃酮類化合物的分子結構[4]，而料液比和提取時間的增加又導致生產成本以及提取周期提高[7];反之，當各影響因素設定水平低于最佳值時，導致黃酮類物質的滲透、溶解和擴散效率降低[8]，浸提物提取不充分。

試驗研究結果表明，對黃芪總黃酮提取率影響的主次因素依次為料液比>乙醇濃度>水浴溫度>提取時間，同時總黃酮的最優提取工藝參數為A3B1C3D1，即乙醇濃度為90%、水浴溫度為80℃、料液比為1∶12、提取時間為2?h，該提取條件下，黃芪總黃酮提取率為0.286%。此方法操作簡便、穩定合理，可作為黃芪總黃酮的最優提取工藝參數。

參考文獻

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