細胞因子信號轉導抑制蛋白-1對高糖環境下腎小球系膜細胞生長的影響

高美珠　吳家斌　張麗

[摘要] 目的 探討細胞因子信號轉導抑制蛋白-1（SOCS-1）及高糖培養條件對腎小球系膜細胞（HMC）生長的影響。方法 體外培養人腎小球細胞，應用脂質體2000轉染SOCS-1 siRNA表達質粒及SOCS-1 無意義siRNA表達質粒。分為：對照組為甘露醇組;高糖模型組;高糖模型組+SOCS-1 siRNA干擾;高糖模型組+無意義siRNA，高糖模型組用 DMEM 培養液中加入葡萄糖，終濃度為30 mmol/L;流式檢測細胞凋亡。Western印跡和熒光定量PCR檢測系膜細胞信號轉導和轉錄活化因子3（STAT3）和核轉錄因子KappaB（NF-κB）的表達。 結果 高糖+SOCS-1干擾組細胞凋亡率1.01%，對照組1.52%，高糖模型組1.95%，SOCS-1 siRNA干擾組細胞凋亡率下調，差異有統計學意義（P<0.05）。高糖模型組相對于對照組，Western Blot檢測顯示NF-kB水平表達上調[（1.21±0.08） vs （0.47±0.04），t=9.49，P<0.01];STAT3表達上調[（1.37±0.12） vs （0.54±0.06），t=10.64，P<0.01];SOCS-1 siRNA干擾組相對于無意義siRNA組，NF-kB水平表達上調[（0.80±0.08） vs （0.32±0.02），t=10，P<0.01]、STAT3表達上調[（0.87±0.10） vs （0.32±0.02），t=9.17，P<0.01]。（RT-PCR檢測提示高糖模型組相對于對照組，NF-kB[（1.15±0.15）vs （0.80±0.16），t=2.9，P<0.05]、STAT3[（0.75±0.02）vs （0.46±0.09），t=5.686，P<0.01]表達上調;SOCS-1 siRNA干擾組相對于無意義siRNA組，NF-kB[（1.15±0.17）vs （0.80±0.09），t=3.18，P<0.05]、STAT3[（0.88±0.06）vs （0.40±0.01），t=13.7，P<0.01]表達上調。 結論 高糖環境會上調HMC的JAK/STAT信號通路，促進HMC的生長;干擾SOCS-1會上調JAK/STAT信號通路，并促進NF-κB的表達，降低細胞凋亡率，促進高糖環境下HMC的生長。

[關鍵詞] SOCS-1;HMC;高糖;STAT3

[中圖分類號] R4? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-0742（2019）07（b）-0037-05

Effect of Cytokine Signal Transduction Inhibitor-1 on the Growth of Mesangial Cells in High Glucose Environment

GAO Mei-zhu， WU Jia-bin， ZHANG Li

Department of Nephrology， Fujian Provincial Hospital， Fuzhou， Fujian Province， 350001 China

[Abstract] Objective To investigate the effects of cytokine signal transduction inhibitor-1 （SOCS-1） and high glucose culture conditions on the growth of mesangial cells （HMC）. Methods Human glomerular cells were cultured in vitro， and SOCS-1 siRNA expression plasmid and SOCS-1 nonsense siRNA expression plasmid were transfected with liposome 2000， and were divided into： control group as the mannitol group; high glucose model group; high glucose model group + SOCS-1 siRNA interference; high glucose model group + meaningless siRNA， high glucose model group with DMEM culture medium added glucose， the final concentration was 30 mmol/L; flow detection of apoptosis; Western blot and real-time PCR were used to detect the expression of mesangial cell signal transduction and transcriptional activator 3 （STAT3） and nuclear transcription factor KappaB （NF-κB）. Results The apoptotic rate was 1.01% in the high glucose+SOCS-1 interference group， 1.52% in the control group， and 1.95% in the high glucose model group. The apoptosis rate of the SOCS-1 siRNA interference group was down-regulated， the difference was statistically significant （P<0.05）. Compared with the control group， Western Blot showed that the expression of NF-kB was up-regulated [（1.21±0.08） vs （0.47±0.04）， t=9.49， P<0.01]; STAT3 expression was up-regulated[（1.37±0.12） vs （0.54±0.06）， t=10.64， P<0.01]; SOC-kB level was up-regulated in SOCS-1 siRNA interference group compared with non-meaningful siRNA group [（0.80±0.08） vs （0.32±0.02）， t=10， P<0.01]， STAT3 expression was up-regulated [（0.87±0.10） vs （0.32±0.02）， t=9.17， P<0.01]. RT-PCR detection indicated that the high glucose model group was compared with the control group， NF-kB [（1.15±0.15） vs （0.80±0.16）， t=2.9， P<0.05]， STAT3[（0.75±0.02） vs （0.46±0.09）， t=5.686， P<0.01] expression up-regulation; SOCS-1 siRNA interference group vs. nonsense siRNA group， NF-kB[（1.15±0.17） vs （0.80±0.09） ， t=3.18， P<0.05]， STAT3 [（0.88±0.06） vs （0.40±0.01）， t=13.7， P<0.01] expression was up-regulated. Conclusion The high glucose environment up-regulates the JAK/STAT signaling pathway of HMC and promotes the growth of HMC. Interfering with SOCS-1 up-regulates JAK/STAT signaling pathway， promotes the expression of NF-κB， decreases the apoptosis rate， and promotes the growth of HMC in high glucose environment.

[Key words] SOCS-1; HMC; High glucose; STAT3

腎小球系膜細胞（HMC）的過度增殖是導致腎間質纖維化及腎小球硬化的重要原因，甚至會導致腎臟病變，典型的例子就是糖尿病并發癥糖尿病腎病。JAK/STAT（Janus激酶-信號傳導及轉錄激活因子）信號通路是細胞內一連串蛋白質的相互作用造成的轉導過程，受多種細胞因子和生長因子激發，與細胞的增殖、分化與腫瘤發生等多種行為密切相關[1]。研究顯示在糖尿病腎病的發病過程中JAK/STAT信號通路較為活躍，并發揮了重要作用[2]，這個信號通路中，相應的細胞因子會促使STAT磷酸化，磷酸化的STAT則會促進下游諸多基因的表達，SOCS-1在此通路中起著負調控因子的作用[3]。糖尿病帶來高血糖，而糖濃度同樣影響細胞的生長。高糖環境下腎小球系膜細胞生長的影響，以及SOCS-1在這個過程中的作用，是該實驗試圖探索的內容。該研究時間為2017年11月—2018年3月。

1? 材料與方法

1.1? 實驗材料

細胞系：293T，購自北納細胞資源庫;SOCS-1 siRNA：NCBI查找SOCS1基因序列，種屬為人，設計siRNA，將siRNA序列在NCBI中的人源非冗余基因數據庫進行Blast比對，排除對SOCS-1之外的基因有干擾的序列，再交由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2? 試劑與儀器

鼠單克隆抗體GAPDH（中杉金橋， TA-08）;兔多克隆抗體NF-KB（Bioss， bs-0465R）;兔多克隆抗體（STAT3， Boster-A5511）;羊抗鼠IgG （中杉金橋， ZB-2305）;羊抗兔IgG（中杉金橋， ZB-2301）;Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit（MULTI SCIENCES， AP101-100-kit）;流式細胞儀（艾森生物， NovoCyte 2060R）;Trizon Reagent（康為世紀， CW0580S）;超純RNA提取試劑盒（康為世紀，CW0581M）;HiFiScript cDNA Kit（康為世紀， CW2569M）;UltraSYBR Mixture（康為世紀， CW0957M）;熒光PCR儀（伯樂生命醫學產品（上海）有限公司， CFX ConnectTM） ;細胞裂解液（普利萊， C1053）;PMSF（索萊寶， A1514061）;超敏發光液（賽默飛， RJ239676）;BSA（索萊寶， A8020）;冷凍高速離心機（常州中捷實驗儀器制造有限公司， TGL-16D）;蛋白垂直電泳儀（北京市六一儀器廠， DYY-6C）;超高靈敏度化學發光成像系統（伯樂生命醫學產品（上海）有限公司， Chemi DocTM XRS+）;紫外分光光度計（上海美譜達儀器有限公司， UV-1600PC型）;BCA蛋白定量試劑盒（康為世紀， CW0014S）;Acrylamide（Ultra Pure Grade， A8080）;雙丙烯酰胺（DAMAO）;Tris（Solarbio， T8060）;Marker（Thermo， #26617）;PVDF膜（Millipore， IPVH 00010）。

1.3? 細胞培養與轉染siRNA

細胞培養使用DMEM完全培養基，對照組的DMEM培養液中加入甘露醇，終濃度為30 mmol/L;高糖組的DMEM培養液中加入葡萄糖，終濃度為30 mmol/L，置于37 ℃，5% CO2培養箱中，當六孔板中細胞密度達90%時，準備轉染，將DMEM完全培養基取出復溫;取滅菌的EP管，每管加125 μL Opti-MEM，加入5 μL Lipofectamine;另取EP管，加入質粒混合液2.5 μg，加入5 uL的P3 000輕輕混勻后室溫靜置5 min;將上述兩個EP管混勻，室溫靜置60 min，將混合液滴到六孔板中對應的孔內，將細胞放回培養箱培養48 h后用于檢測。siRNA序列（5'-3'）：SOCS1-siRNA-1的正義鏈：UCGCCCUUAGCGUGAAGAUTT，反義鏈：AUCUUCACG CUAAGGGCGATT;SOCS1-siRNA-2的正義鏈：GGUUG UUGUAGCAGCUUAATT，反義鏈：UUAAGCUACAACAA CAACCTT;SOCS1-siRNA-3的正義鏈：CCCAGUA UCUUUGCACAAATT，反義鏈UUUGUGCAAAGAUACU GGGTT。

1.4? 流式檢測細胞凋亡

使用Apoptosis Positive Control Solution調整儀器參數。收集各組細胞用EP管分裝好后向每管中加入1 mLPBS溶液2 000 rpm/2min，棄上清，重復3次。離心收集（1～5）×105個細胞。每個樣對應用100 μL的5×Binding Buffer 稀釋到1×作為工作液，取500 uL工作液重懸細胞。每管加入5 μL Annexin V-FITC 熒光染料和10 μL PI熒光染料。渦旋混勻后，室溫避光孵育5 min。在流式細胞儀上，通過 FITC 檢測通道檢測Annexin V-FITC ，通過PE檢測通道檢測 PI。

1.5? Western Blot

取各組細胞，每組取約106個細胞，加入200～300 μL含PMSF的RIPA裂解液，放冰上裂解30 min后，收集到2 mLEP管中，超聲波震蕩5 min。之后于4 ℃，10 000 rpm/min離心10 min，吸取上清，即可獲得總蛋白。根據BCA試劑盒測定蛋白樣品濃度，取等量總蛋白上樣進行SDS-PAGE電泳2 h，后濕法轉PVDF膜50 min。使用脫脂牛奶封閉PVDF膜2 h，之后清洗PVDF膜;置PVDF膜于一抗溶液孵育，4 ℃過夜;清洗PVDF膜，置于二抗溶液中室溫孵育2 h。在膜上滴加曝光液，在Chemi DocTM XRS+系統中成像拍照，分析各條帶灰度值，目的條帶和內參條帶灰度值的比值為目的基因的相對表達量。

1.6? 熒光定量PCR

取各組細胞進行RNA提取，提取RNA后根據逆轉錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，以GAPDH為內參，進行熒光定量PCR，算出各組細胞中NF-kB、STAT3的相對表達量。引物信息：NF-KB F引物序列為ACCCACCCCACCATCAA，NF-KB R引物序列為CAGAGCCGCACAGCATT，這兩者引物長度17bp，產物長度311bp，退火溫度57.7 ℃。STAT3 F引物序列為ACCAAGCGAGGACTGAGCA，引物長度19bp，STAT3 R引物序列為CCAGACCCAGAAGGAGAAGC，引物長度20bp，這兩個引物的產物長度都為147bp，退火溫度60.5 ℃。GAPDH F引物序列為GAAGGTCGGAGTCAACGGAT，引物長度20bp，GAPDH R引物序列為CCTGGAAGATGGTGATGGG，引物長度19bp，這兩個引物的產物長度為221bp，退火溫度58.6 ℃。引物合成公司：通用生物系統（安徽）有限公司。

1.7? 統計方法

所有數據均用SPSS 19.0統計學軟件處理，計量單位用（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2? 結果

2.1? 各組細胞凋亡檢測結果

高糖+SOCS-1干擾組細胞凋亡率（1.01%）低于對照組（1.52%），而對照組細胞凋亡率低于高糖組（1.95%）。差異有統計學意義（P<0.05）。見表1、圖1。

2.2? Western Blot檢測NF-kB、STAT3在各組細胞中的表達情況

結果以NF-kB、STAT3與內參蛋白表達條帶的灰度值比表示。結果見圖2，Western Blot檢測顯示NF-kB水平表達上調[（1.21±0.08）比（0.47±0.04），t=9.49，P<0.001];STAT3表達上調[（1.37±0.12）比（0.54±0.06），t=10.64，P<0.001];SOCS-1 siRNA干擾組相對于無意義siRNA組，NF-kB水平表達上調[（0.80±0.08）比（0.32±0.02），t=10，P<0.01]、STAT3表達上調[（0.87±0.10）vs（0.32±0.02），t=9.17，P<0.01]。各組之間的差異有統計學意義（P<0.01）。

2.3? RT-PCR檢測NF-kB、STAT3在各組細胞中的表達情況

高糖模型組相對于對照組，NF-kB[（1.15±0.15） vs（0.80±0.16），t=2.9，P<0.05]、STAT3[（0.75±0.02） vs （0.46±0.09），t=5.686，P<0.01]表達上調;SOCS-1 siRNA干擾組相對于無意義siRNA組，NF-kB[（1.15±0.17） vs（0.80±0.09），t=3.18，P<0.05]、STAT3[（0.88±0.06） vs （0.40±0.01），t=13.7，P<0.01]表達上調。差異有統計學意義（P<0.05）。見圖3。

3? 討論

糖尿病腎病已成為導致終末期腎病的首位病因，發病率高且危害嚴重[4]。腎小球系膜細胞的過度增殖是導致糖尿病腎病腎間質纖維化及腎小球硬化的重要原因。其與多種因素有關，如葡萄糖代謝紊亂，細胞因子異常表達，炎癥因子和氧化應激[5]。而其中炎癥信號通路的激活扮演重要角色。現有許多研究顯示，在糖尿病腎病的發病過程中JAK/STAT信號通路較為活躍，并發揮了重要作用。SOCS-1和SOCS-3在JAK/STAT通路中起著負調控因子的作用。SOCS-1能夠調節多種生理過程。在多發性骨髓瘤中，SOCS-1的表達異常偏低，相應的JAK/STAT3通路持續活躍，助長了病癥的惡化[6]。SOCS-1的過表達可以調節JAK/STAT信號通路的活性，降低了腎小管上皮細胞中TNF-α介導的氧化應激和凋亡[7]。此外還有研究報道，SOCS-1協同TRL家族參與對病毒的免疫反應，這又進一步加深了人們對SOCS-1的調控的重要性的認識[8]。

該實驗建立了腎小球系膜細胞高糖模型，并檢測了高糖培養條件下JAK/STAT信號通路中STAT3表達情況，發現高糖模型組相對對照組STAT3表達上調，凋亡率也略上調，而對JAK/STAT信號通路中負調控因子SOCS-1進行siRNA干擾后，其與無意義siRNA組比較，STAT3表達上調[（0.87±0.10） vs （0.32±O.02），P<0.01]。而凋亡率也有明顯下降。這些結果說明高糖會促使腎小球系膜細胞JAK/STAT信號通路上調，而抑制這個通路的負調控因子SOCS-1后，此通路能進一步上調，并降低細胞凋亡率，最終促進血管內皮細胞增殖。而史永紅等[9]應用脂質體2000分別轉染pCR3.1-SOCS-1表達質粒和pCR3.1空質粒載體，與空載體對照組相比，SOCS-1過表達組系膜細胞STATI和STAT3的磷酸化水平顯著下降（P<0.05）;MCP-1 mRNA表達下調[（0.34+0.04）vs（0.42±0.05），P<0.05]。其與該實驗正反兩方面證實了SOCS-1對高糖誘導的腎小球系膜細胞JAK/STAT信號起負反饋的作用。近年來陸續有研究報道關于高糖環境中SOCS蛋白及信號通路對系膜細胞的影響。PI3K/STAT1/3信號通路介導高糖誘導的細胞外基質積聚和系膜細胞中SOCS-3的上調[10]。王晨等[11]以脂質體為載體將 PCR3.1 SOCS 3轉染至體外培養的HMC，Western Blot檢測高糖+SOCS3基因轉染組比較高糖+空質粒轉染組及對照組，STAT1蛋白酪氨酸磷酸化水平顯著下降[（0.978±0.098）vs（0.645±0.067），P<0.05]。

核轉錄因子KappaB（NF-κB）通路是炎癥反應的中心環節，參與了糖尿病腎病的發病。體外試驗也證實了高糖環境中NF-κB損傷腎小管上皮細胞[12]。NF-κB信號傳導是復雜的， NF-κB的激活由磷酸化IκBα的多泛素化介導，然后是蛋白酶體降解[13-14]。其穩定性受多種蛋白質修飾的調節，包括磷酸化，泛素化和谷胱甘肽化，以及活性氧和氮的修飾。有學者研究巨噬細胞中一氧化氮合成酶1合成的NO導致SOCS1的蛋白水解，減輕其對NF-κB轉錄活性的抑制[15]。有報道SOCS2過表達可使高糖誘導下的足細胞中的TLR4/NF-κB途徑失活[16]。但目前為止SOCS-1對高糖誘導下NF-κB作用的試驗研究甚少，而該實驗結果顯示SOCS-1 siRNA干擾組相對于無意義siRNA組，NF-kB表達上調，提示SOCS-1可抑制高糖誘導下系膜細胞NF-κB的表達。其具體通過何種機制發揮作用有待進一步深入研究。

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