注射催產素對小鼠骨密度和成骨細胞分化影響的實驗研究

劉璇 魯薦 劉一鳴

1.東南大學醫學院，江蘇 南京 210009 2.南京市第一醫院，江蘇 南京 210006

隨著人口老齡化進程加快，由骨質疏松癥誘發的骨折將是社會面臨的一大公共健康問題，并在絕經后婦女人群中顯得尤為嚴重。絕經后骨質疏松癥是原發性骨質疏松癥中最常見的類型，多在絕經后5～10年發病，是困擾女性健康的嚴重疾病之一。

催產素(oxytocin，OT)是一種垂體后葉激素，其主要生理功能包括促進分娩期子宮收縮[1]、哺乳期排乳[2]和影響社會行為[3]。近年來，研究發現成骨細胞和破骨細胞均表達催產素受體，催產素對骨代謝具有直接調節作用，它能促進成骨細胞分化和骨形成功能、促進破骨細胞分化但抑制骨吸收功能，生理狀態下它的整體作用是促進骨形成和骨量累積，并且催產素參與調節妊娠期母體的骨重建，從而揭示了催產素新的生理功能[4-5]。最近，有研究者報道絕經后婦女骨質疏松的發生與其體內低催產素水平有關，而在低血清雌激素水平的婦女體內高骨密度與高催產素水平有關[6]，該機制可以通過催產素對骨代謝的影響來解釋。

然而，以往的一些研究多是基于體外細胞培養實驗，本研究采用2月齡雌性C57/B6小鼠，行雙側卵巢切除術建立小鼠骨質疏松模型，并給予催產素腹腔注射，分別從骨密度、細胞分化、分子水平鑒定小鼠骨代謝水平，進一步深入探究催產素對骨代謝的調控作用。

1 材料和方法

1.1 實驗分組

所有實驗小鼠均由東南大學醫學院動物實驗中心購置并飼養(SPF 級)，實驗方案已通過實驗動物倫理委員會批準，在實驗的執行過程中一切按照倫理準則進行。選取同批次健康的2月齡雌性C57/B6小鼠15只[平均體重(25±1)g]，隨機分成3組(每組5只)： ①對照組(C)，②造模組(OVX)，③造模+催產素注射組(OVX+OT)。造模期每天按照對照組攝食量給予其他組定量食物(動物專用普通級飼料，不添加含豆類的原料，其中鈣含量10 g/kg)，自來水自由攝取。

1.2 動物造模

根據前期研究經驗和結果[4-5]，本實驗動物造模方法如下：所有小鼠經腹腔注射戊巴比妥麻醉(給藥濃度為40 mg/kg)，逐層切開皮膚、肌層，進入腹腔，找出雙側卵巢。OVX組、OVX+OT組小鼠行雙側卵巢切除術，結扎輸卵管和血管，將卵巢完整切除，逐層縫合；C組小鼠僅切除卵巢周圍部分脂肪(其質量略同卵巢組織)，不切除卵巢。術后所有小鼠均常規腹腔注射青霉素(5萬U/d)預防感染，持續3d。參照前期研究中的注射量[4]，術后1周起OVX+OT組每天腹腔注射催產素5μg(以生理鹽水0.2 mL溶解)，C組和OVX組每天注射0.2 mL生理鹽水，共注射8周。

1.3 骨灰度測量

采用東南大學生物醫學工程學院的Hiscan骨灰度測量儀檢測小鼠左股骨和腰椎L4～6骨灰度。每次開機首先進行Quality Control，調節電壓為50 mV和電流50 mA，并進行機器預熱30 min后方可開始測量。將麻醉的小鼠取俯臥位四肢展開，固定在儀器配套的粘膠托盤上，再將托盤放置到儀器掃描平臺上進行全身掃描。掃描結束后，通過儀器分析軟件Image J測量腰椎L4～6、左股骨的骨灰度(骨灰度值越高，則骨密度越低)。

1.4 小鼠骨髓細胞的分離和培養

催產素注射8周后，采取斷頸法處死小鼠，立刻提取各組小鼠骨髓細胞，利用含1 mmol/L 2-磷酸抗壞血酸鎂(L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate, A2P)的α-15全培養液(αMEM + 15% FBS + 1% penicillin-streptomycin)誘導其向成骨細胞分化，且進一步設外加催產素組進行細胞培養(參照前期研究中的10-8mol/L作用濃度[4-5])。細胞培養分組(共6組)： ①C組，②OVX組，③OVX+OT組，④C組+OT(10-8mol/L)，⑤OVX組+OT(10-8mol/L)，⑥OVX+OT組+OT(10-8mol/L)。

1.5 ALP染色

隨著骨髓基質細胞向成骨方向分化，逐漸形成成纖維細胞集落形成單位(colony forming unit-fibroblasts, CFU-f)，即成骨細胞前體細胞，具有高堿性磷酸酶活性。實驗中，當細胞培養至第12天使用Sigma公司的ALP試劑盒(86R-1KT)進行堿性磷酸酶染色，以鑒定成骨細胞的分化狀況。染色后，可見 ALP 陽性的細胞集落呈紫紅色，采用Matlab軟件編程計算染色面積，對比分析各組染色結果。

1.6 Von Kossa染色

隨著成骨細胞的分化成熟，形成成骨細胞集落形成單位(colony forming unit -osteoblasts, CFU-ob)，大約培養至第21天，肉眼便可見白色的礦化結節。實驗中，待細胞培養至28 d進行Von Kossa染色，以鑒定成熟成骨細胞的礦化。染色步驟如下：棄去培養板中的培養液，用10%甲醛室溫下固定后加入5%硝酸銀溶液，置于紫外燈下照射直至鈣結節變為黑色，再用5%硫代硫酸鈉水溶液處理和0.05%番紅O復染，晾干后采用Matlab軟件編程計算染色面積，對比分析各組染色結果。

圖1 小鼠股骨和腰椎骨灰度測量Fig.1 Measurement of bone gray values of the femur and lumbar vertebra in mice

1.7 qPCR檢測

細胞接種30 d后，進行qPCR檢測成骨細胞分化水平。本實驗進行目標基因表達差異分析(管家基因GAPDH作為參照)，用羅氏SYBR Green Mix熒光染料定量檢測，以鑒定催產素對成骨細胞分化的影響。實驗過程如下：收集對數生長期的細胞，按106～107個細胞：1 mL Trizol的比例向其中加入Trizol(Invitrogen，15596-026)使細胞充分裂解，經沉淀、洗滌和溶解RNA后再進行反轉錄。反轉錄過程為30 μL反應體系：滅活DEPC水10.25 μL，MgCl2(25 mmol/L)6 μL，10×RT Buffer 3 μL，dNTP mix(10 mmol/L)3 μL，Oligo dT-Adaptor Primer(2.5pmol/mL))1.5 μL，樣品RNA 4 μL，RNA酶抑制劑(40 U/μL)0.75 μL，AMV Reverse Transcriptase(5 U/μL)1.5 μL。反轉錄反應條件為：42 ℃ 30 min→99 ℃ 5min→5 ℃ 5min(1 Cycle)，用以對反應產物cDNA進行擴增。qPCR(StepOne Plus, ABI)體系(共20 μL)：羅氏 SYBR Green Mix 10 μL，上/下游引物0.6 μL(見表1)，dd H2O 6.8 μL，cDNA 2 μL。擴增反應條件為：94 ℃預變性2 min，之后94 ℃變性45 s、58 ℃退火45 s、72 ℃延伸45 s，進行35個循環擴增，再以72 ℃延伸7 min。

表1成骨相關基因qPCR檢測的引物序列

Table1The primer sequences for qPCR detection of osteogenesis-related genes

基因引物名稱引物序列Osteopontinm-Osteopontin/A5’-ATG GTC ATC ATC GTC GTC C-3’m-Osteopontin/S5’-ATC TCA GAA GCA GCC TCT CC-3’Osterixm-Osterix/A5’-AAT AGG ATT GGG AAG CAG AAA G-3’m-Osterix/S5’-TAT GCT CCG ACC TCC TCA AC-3’Runx2m- Runx2/A 5’-CCG TCA GCG TCA ACA CCA TC-3’m-Runx2/S5’-CGT CAG CAT CCT ATC AGT TC-3’

1.8 統計學處理

所有數據均以平均值±標準差表示，采用SPSS軟件統計單因素方差分析方法進行分析，組間比較采用Dunnett’s test檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。統計結果的圖形化由Prism繪圖軟件完成。

2 結果

2.1 催產素能緩解去勢小鼠的骨丟失

骨質疏松癥是一種骨骼退行性疾病，其特征為低骨密度和骨組織微結構劣化，從而增加骨折易感性。骨密度是骨礦物代謝中量化骨量的重要指標，是評價和判斷骨質疏松癥的金標準[7]。本研究分別于小鼠注射催產素前和注射8周后，測量小鼠腰椎L4～6和左股骨兩處骨量丟失敏感部位的骨灰度(見圖1)，骨灰度值越高，骨密度越低。結果顯示催產素注射8周后，OVX組小鼠的左股骨骨灰度較C組增加了18.3%(P<0.001)，腰椎L4～6骨灰度較C組增加了15.2%(P<0.001)，即OVX組小鼠股骨和腰椎的骨密度均顯著降低，說明小鼠骨質疏松模型成功建立。與C組相比，OVX+OT組的左股骨骨灰度僅增加了4.0%(P<0.05)，但其比OVX組則降低了12.1%(P<0.001)；同樣OVX+OT組的腰椎L4～6骨灰度僅比C組增加了4.8%(P<0.001)，但比OVX組則降低了9.0%(P<0.001)，即注射催產素明顯提高了OVX+OT組小鼠的股骨和腰椎骨密度，有效地彌補了卵巢切除引起的骨量丟失，表明催產素促骨形成作用顯著(圖2和圖3)。

圖2 催產素注射前和注射8周后小鼠左股骨骨灰度值比較(*P<0.05,****P<0.0001)Fig.2 Changes of bone gray values of the left femur of mice before and 8 weeks after oxytocin injection(*P<0.05,****P<0.0001)

圖3 催產素注射前和注射8周后小鼠腰椎L4～6骨灰度值比較(***P<0.001,****P<0.0001)Fig.3 Changes of bone gray values of the lumbar vertebrae L4-L6 of mice before and 8 weeks after oxytocin injection (***P<0.001,****P<0.0001)

2.2 催產素促進成骨細胞的體外分化及礦化能力

成骨細胞起源于間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)，它的主要特征包括高堿性磷酸酶活性，以及能夠合成、分泌骨基質。進行ALP染色可反映成骨細胞分化情況，鈣結節染色可以檢測成熟成骨細胞的體外礦化能力。如圖4所示的ALP染色結果，OVX組細胞集落最少，成骨細胞分化較C組差，染色面積降低了86.3%；OVX+OT組成骨細胞分化情況較OVX組好，染色面積比OVX組增加了322.5%。而加入催產素體外培養的3組細胞其分化趨勢與以上未加催產素的3組一致，其中OVX組外加OT(10-8mol/L)培養后染色面積比C組外加OT(10-8mol/L)培養降低了52.3%，OVX+OT組外加OT(10-8mol/L)培養后染色面積較OVX組外加OT(10-8mol/L)培養增加了67.9%。且外加催產素的3組均比其相應未加催產素組分化更好，如C組外加OT(10-8mol/L)培養后染色面積增加了43.4%，OVX組外加OT(10-8mol/L)培養后染色面積增加了398.3%，OVX+OT組外加OT(10-8mol/L)培養后染色面積增加了98.0%。Von Kossa染色結果顯示，OVX組細胞集落和鈣結節較C組明顯少且小，染色面積降低了75.3%；OVX+OT組細胞集落和鈣結節較OVX組多，染色面積增加了62.3%。同樣，細胞外加催產素培養后其細胞集落和鈣結節生長均比未加入催產素的幾組好，如C組外加OT(10-8mol/L)培養后染色面積增加了12.8%，OVX組外加OT(10-8mol/L)培養后染色面積增加了9.7%，OVX+OT組外加OT(10-8mol/L)培養后染色面積增加了66.5%，且外加催產素3組間的變化趨勢與未加催產素組一致, 其中OVX組外加OT(10-8mol/L)培養后染色面積比C組外加OT(10-8mol/L)培養降低了76%，OVX+OT組外加OT(10-8mol/L)培養后染色面積較OVX組外加OT(10-8mol/L)培養增加了146.4%(圖5)。以上染色結果均表明，小鼠注射催產素和細胞體外培養外加催產素均能促進成骨細胞的分化和成熟成骨細胞的體外礦化。

圖4 催產素促進成骨細胞的ALP活性a：C組, b：OVX組, c：OVX+OT組, d：C組+OT(10-8mol/L), e：OVX組+OT(10-8 mol/L), f：OVX+OT組+ OT(10-8 mol/L)Fig.4 Oxytocin promoted ALP activity of osteoblastsa： C group, b： OVX group, c： OVX+OT group, d： C group +OT (10-8 mol/L), e： OVX group+OT (10-8 mol/L), f： OVX+OT group + OT (10-8 mol/L)

圖5 催產素促進成熟成骨細胞的體外礦化a： C組, b:OVX組, c：OVX+OT組, d：C組+OT(10-8 mol/L), e：OVX組+OT(10-8 mol/L), f：OVX+OT組+OT(10-8 mol/L)Fig.5 Oxytocin promoted osteoblast mineralization in vitro a： C group, b： OVX group, c： OVX+OT group, d： C group +OT (10-8 mol/L), e： OVX group+OT (10-8 mol/L), f： OVX+OT group + OT (10-8 mol/L)

2.3 催產素促進成骨相關基因的表達

實驗采用qPCR檢測了催產素注射對成骨細胞分化標志物骨橋蛋白(osteopontin, OPN)、Runx2(runt-related transcription factor 2)和鋅指轉錄因子Osterix表達的影響。OPN是反映成骨細胞分化成熟的重要標志[8]；Runx2又稱矮小相關轉錄因子2，它能誘導成骨細胞分化和增加未成熟成骨細胞的數目，從而促進成熟骨形成[9]；Osterix也在促進成骨細胞分化和新骨形成過程中起重要作用[10]。qPCR結果顯示，OVX組成骨相關基因OPN、Runx2和Osterix的 mRNA水平明顯低于C組(P<0.001)，再次驗證了骨質疏松小鼠模型成功建立。OVX+OT組成骨細胞OPN、Runx2和Osterix的 mRNA水平明顯高于OVX組(P<0.0001)，特別是OPN表達比OVX組增加了3.9倍，Osterix表達較C組增加了0.5倍，較OVX組則增加了15.5倍，說明注射催產素能夠使3種成骨相關標志物的mRNA表達顯著增加，這也與小鼠骨密度測定、細胞染色結果相一致，即催產素能夠促進小鼠體內骨合成代謝作用(如圖6)。

圖6 催產素促進成骨相關基因OPN，Runx2和Osterix的表達(* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, **** P<0.0001)Fig.6 Oxytocin promoted the expression of osteogenesis-related genes OPN, Runx2, and Osterix (*P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, **** P<0.0001)

3 討論

隨著近年來研究者們先后揭示了人的成骨細胞和破骨細胞上均存在催產素受體，以及一些骨質疏松癥相關疾病和生理過程中常伴有催產素水平的改變，Dursun等[11]提出了催產素可能與骨質疏松癥相關的推測。研究者前期通過成骨細胞的體外培養與相關檢測鑒定也證明，催產素通過上調BMP-2來調控成骨細胞特異性轉錄因子Schnurri-2、Osterix、激活轉錄因子(activating transcription factor 4，ATF4)的表達，從而促進成骨細胞的分化及其礦化功能[4]。

然而，以往的一些研究結果多是基于體外細胞培養實驗，直到2007年，Elabd等[12]對骨質疏松模型大鼠行肌肉注射催產素，一組為大劑量短期作用(40μIU/kg，持續6周)，一組為低劑量長期作用(8μIU/kg，持續12周)，其血清生化檢測、骨組織形態學檢測對比結果均顯示催產素能夠促進成骨細胞增殖及其骨形成功能，這也是首次從在體水平上探索了催產素對骨重建的調節作用。本實驗通過長期(8周)催產素注射和監測來完善催產素調節骨代謝的認識，分別從骨密度、細胞分化、分子水平鑒定催產素對骨代謝的調控作用。研究結果表明，骨質疏松造模小鼠的骨量明顯低于假手術對照組小鼠，而催產素腹腔注射能夠提高骨質疏松造模小鼠的骨密度，通過提高成骨相關基因OPN、Runx2和Osterix的表達促進成骨細胞的分化和體外礦化，這進一步提示注射催產素能夠促進骨質疏松造模小鼠的骨合成代謝。最近，有研究者通過組織學檢測證明了皮下注射催產素能促進去勢大鼠股骨干骺端移植骨的整合以及緩解骨質疏松造成的骨量丟失[13]；Cheng等[14]研制了一種負載催產素的SBA-15多孔顆粒，通過體外細胞系共培養檢測ALP及I型膠原表達以及體內兔顱骨缺損移植檢測鈣沉積，證明了該材料在體內外均具有良好的促骨修復功能，以上文獻報道均與本研究結論一致。

絕經后骨質疏松癥是原發性骨質疏松癥中最常見的類型，其主要原因是由于卵巢功能衰退引起的雌激素分泌不足。激素替代治療為治療骨質疏松癥的首選方案[15]，雌激素可通過雌激素受體、細胞因子、細胞凋亡和骨保護素等多條途徑促進成骨細胞的骨形成，抑制破骨細胞的骨吸收，從而達到治療骨質疏松的目的。雌激素與催產素在很多系統中的相互作用已經被廣泛研究報道。如雌激素能夠使去勢大鼠血漿中的催產素濃度升高[16]，上調垂體、下丘腦、子宮的催產素受體mRNA表達[17-18]，從而增加這些臟器對催產素的敏感性。研究者前期實驗結果也提示，外源性雌激素可能增加外周催產素生成，或上調成骨細胞催產素受體的表達，提高骨骼對催產素的敏感性，催產素可能又同時調節雌激素受體的表達和活性，從而兩者協同促進骨形成和抑制骨吸收。而當催產素受體敲除后，雌激素與催產素兩者間的相互調節作用減弱，導致雌激素對骨密度的影響不顯著，從而降低雌激素的骨合成代謝作用[19]。Colaianni等[20]最新研究報道了人和鼠的成骨細胞均能分泌催產素，并且受到雌激素激活MAPK的調控，進一步研究發現17-雌二醇能夠通過促進催產素受體表達和催產素產生起到促進骨代謝的作用，并且在雌激素作用下，催產素能夠成為自身分泌的“受體”來刺激自分泌產生更多的催產素，以進一步放大雌激素的成骨調節作用，并提出雌激素誘導的催產素反饋徑路在成骨代謝中起到重要作用[21]。另外，最新臨床研究也表明，在絕經后婦女人群中，合并骨質疏松者其體內血漿催產素水平明顯低于相應正常人群，并且低催產素水平與低骨轉換水平有關[6]。由此可見，催產素在雌激素調節骨代謝過程中的作用不可忽視。結合上述實驗動物和臨床病例研究結果，可以推測血漿催產素水平可作為血清標志物為絕經后骨質疏松臨床診斷提供依據，催產素也有望應用于骨質疏松臨床治療。但絕經后骨質疏松癥為多因素性疾病，激素間的相互作用的深入闡明將進一步指導臨床激素補充的合理應用。

此外，妊娠后期母體內催產素水平的升高參與調節母體的骨重建以實現母子間的鈣轉移，胎兒的骨骼發育也具有催產素敏感性[5]，這也揭示了催產素新的生理功能，顯示了其在特殊時期對骨代謝調節的重要生理意義。除催產素之外，目前人們已發現雌激素、甲狀旁腺素、糖皮質激素等多種激素都參與調節妊娠期和哺乳期母體的骨重建[22-24]。但是，對于這些激素對骨代謝的相互協同關系還有待進一步研究，仍可能存在其他未知的骨代謝相關激素和調節因子參與調節妊娠期和哺乳期母體的骨重建，這將需要研究者們去發掘。在這些代謝相關疾病如甲亢、糖尿病等引起的骨質疏松癥中，常伴有血漿催產素水平的改變[25-26]，近年來也陸續有人開展了催產素與糖尿病、肥胖等疾病相關性的實驗研究[27]，對于催產素在其中發揮的骨代謝調節作用，以及血漿中的催產素水平能否輔助作為骨質疏松癥評估、預測和監控的標志物，值得進一步深入探索。

4 結語

近年來，隨著研究人員深入探究催產素對骨代謝的影響[28-30]，進一步豐富了垂體-骨軸理論[31-33]，讓人們對垂體激素的功能有了全新認識，為骨質疏松癥和其他骨代謝疾病的防治提供了新的思路和診療方案。已有研究證明催產素能夠促進骨合成代謝作用，重組催產素及其類似物有望應用于骨質疏松臨床治療，值得注意的是，關于催產素其作用于人體的安全劑量和有效的給藥方案以及患者個體化治療方案的確定還有待系統臨床研究。