海參多糖對腎癌ACHN細胞自噬的影響

李 天，周東梅，劉一帆，江先漢，謝清靈，黃奕橋，殷羽飛

1)廣州醫科大學附屬第五醫院泌尿外科廣州510700 2)廣州醫科大學附屬第五醫院中醫科廣州510700

腎癌是泌尿系統中惡性程度較高的腫瘤，也是最常見的腫瘤之一［1］。自噬是真核生物中普遍存在的現象，AKT/mTOR作為自噬的主要信號通路在腫瘤的發生發展過程中起重要作用。研究［2-3］表明，AKT通路的失活導致mTOR失活，并通過誘導自噬促進癌細胞凋亡。海參多糖是從海參中提取的水溶性物質，可以抑制多種腫瘤細胞的增殖、轉移，同時也有一定的腫瘤細胞殺傷作用［4-5］。本研究探討了海參多糖對腎癌細胞增殖標志物(Ki-67、PCNA)、凋亡標志物(Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9)、自噬相關蛋白(Beclin1、P62、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ)、AKT/mTOR通路相關蛋白(PI3K/p-PI3K、AKT/p-AKT、mTOR)表達的影響，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1．1 主要試劑與儀器 海參多糖(自制，純度 ＞95%)，鼠抗人 PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、GAPDH抗體(美國Santa Cruz公司，使用時PI3K抗體按1∶500稀釋，GAPDH 抗體按1∶5 000稀釋，其余均按1∶1 000稀釋)，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(美國英杰生命技術有限公司);光學顯微鏡、流式細胞儀(上海碧迪生物科學公司)，小型垂直電泳儀及電泳槽、全能型蛋白快速轉膜儀(美國伯樂生命醫學產品有限公司)。

1．2 細胞及分組 腎癌ACHN細胞系購自中國科學院細胞庫，用含體積分數10%胎牛血清和50 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養基于37℃、體積分數5%CO2的環境下無菌培養。量取溶解于培養液中的海參多糖，用0．22μm微孔濾器過濾，分別將終質量濃度調整為50、100、200 mg/L，置于－20℃冰箱保存待用。將ACHN細胞以每孔4×103個接種在96孔板中并于體積分數5%CO2、37℃下溫育12 h，然后分別加入 0(對照)、50、100、200 mg/L 海參多糖100μL培養。

1．3 細胞活力測定 采用 MTT法。24、48、72、96 h后4組細胞吸棄舊培養基并在其中加入含5 g/L MTT的新鮮培養基，37℃溫育4 h。然后用二甲基亞砜溶解甲臜，并用分光光度計測量570 nm處的吸光度值，以吸光度值代表細胞活力。實驗重復3次。

1．4 細胞球形成實驗 將ACHN細胞以每孔1×103個接種在6孔板，按1．2方法分組及處理。48 h后進行結晶紫染色，在200倍光學顯微鏡下選擇2個視野觀察細胞形態并計數每個球體中存在的細胞數量，結果取平均值。實驗重復3次。

1．5 Ki-67、PCNA、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Beclin1、P62、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ、PI3K/p-PI3K、AKT/p-AKT、m TOR 表達的測定 采用Western blot法。海參多糖處理48 h后，使用RIPA裂解緩沖液從ACHN細胞中提取蛋白質。離心后定量，將40μg總蛋白加樣到120 g/L SDS-PAGE凝膠上并轉移到PVDF膜上。將膜與封閉緩沖液在含體積分數0．1%Tween-20的TBS中室溫孵育2 h。充分洗滌后，將膜與次級過氧化物酶標記的IgG在室溫下溫育1 h。以目的蛋白與內參GAPDH條帶灰度值的比值代表目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1．6 細胞凋亡率的測定 將ACHN細胞在6 cm培養皿中以約5×105個的密度進行接種。過夜溫育后，將胰蛋白酶消化的細胞收集在相同的離心管中。離心和洗滌后，將細胞團粒固定在體積分數70%乙醇中。然后將樣品與5μL Annexin V-FITC和5μL PI在25℃黑暗中溫育15 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。

1．7 AKT蛋白表達的定位 將ACHN細胞在玻璃蓋玻片上的12孔板中培養，接種密度為5×105個/mL，并用 0、50、100、200 mg/L 海參多糖處理 24 h。固定細胞樣品，滴加AKT一抗，4℃過夜。將細胞與綴合有Cy3的二抗溫育30 min，然后在室溫下置于含有DAPI的培養基中5 min。用共聚焦激光掃描顯微鏡進行觀察，AKT陽性細胞的細胞質染成紅色，用DAPI標記的細胞核顯現為藍色。

1．8 統計學處理 采用SPSS 21．0進行數據分析。各組細胞所有觀察指標的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 4組細胞活力的比較 結果見圖1。50、100、200 mg/L 海參多糖處理 24、48、72、96 h 后，細胞活力均低于對照組;此外，給藥48 h對ACHN細胞的抑制作用最強，故后續實驗選擇作用時間為48 h。

圖1 各組ACHN細胞活力比較

2．2 各組細胞生長、凋亡情況及增殖、凋亡標志物表達的比較 Western blot檢測 Ki-67、PCNA、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9的表達，結果見圖2、圖3。各組細胞生長、凋亡情況及增殖、凋亡標志物表達的比較，見表1。

圖2 各組ACHN細胞中K i-67、PCNA蛋白的表達

圖3 各組ACHN細胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白的表達

表1 各組細胞生長、凋亡情況及增殖、凋亡標志物表達的比較(n=3)

2．3 各組細胞自噬相關蛋白表達的比較 結果見圖4、表2。可知，海參多糖可降低P62蛋白表達，增加Beclin1蛋白表達。

圖4 各組ACHN細胞中Beclin1、P62和LC3蛋白的表達

表2 各組ACHN細胞自噬相關蛋白表達水平的比較(n=3)

2．4 各組細胞 PI3K/p-PI3K、AKT/p-AKT和m TOR蛋白表達水平的比較 結果見圖5、表3。AKT蛋白的細胞定位見圖6。

圖5 各組ACHN細胞PI3K/p-PI3K、AKT/p-AKT和m TOR蛋白的表達

表3 各組ACHN細胞PI3K/p-PI3K、AKT/p-AKT和m TOR蛋白表達水平的比較(n=3)

圖6 各組ACHN細胞AKT蛋白表達的定位(×100)

3 討論

腎癌是泌尿系腫瘤死亡的第三大原因［6］。主要病理類型為透明細胞癌、乳頭狀癌和嫌色細胞癌等，其中以透明細胞癌最為常見，約占90%［7］。在泌尿系統惡性腫瘤中發病率僅次于膀胱癌［8］。

海參多糖是從海參中提取的天然生物來源的抗腫瘤活性藥物，具有廣譜、高效等優點。在該研究中作者發現，與對照組相比，海參多糖可降低ACHN細胞活力。此外，海參多糖可限制ACHN細胞的球形成能力，降低增殖標志物(Ki-67和PCNA)的表達。以上結果表明海參多糖通過抑制增殖來抑制ACHN細胞活力。細胞凋亡是線粒體膜電位喪失、細胞色素C釋放到胞質溶膠中以及隨后在有核細胞中激活 Caspase-9的特征［9-12］，然后 Cleaved Caspase-9激活效應子Cleaved Caspase-3。該研究結果表明隨著海參多糖質量濃度的增加，凋亡率也隨之增加。此外，在海參多糖的影響下，凋亡相關蛋白(Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9)的表達水平也增加。這些結果證實了海參多糖在ACHN細胞中的促凋亡作用。自噬是各種病理生理過程中的重要機制［13-15］。該研究結果顯示，海參多糖可增加自噬相關蛋白如Beclin的表達水平，而P62的表達水平下降。這些結果表明海參多糖可以有效增強ACHN細胞的自噬。AKT/mTOR途徑在多種腫瘤中是基因靶向的，因此通常被作為癌癥驅動因子激活［16-18］。它參與調節各種細胞功能，包括分化、細胞增殖、存活、黏附、運動和侵襲［19］。腫瘤發生所必需的AKT信號傳導的一個主要下游效應物是mTOR，它參與調節哺乳動物細胞中的自噬。該研究結果顯示，海參多糖可增加PI3K、AKT磷酸化水平，表明PI3K/AKT/mTOR途徑被活化。

綜上，該研究結果表明海參多糖可通過PI3K/AKT/mTOR途徑增強腎癌細胞中自噬相關的細胞凋亡，相關機制仍需要進一步的研究來驗證。