COX-2抑制劑對慢性前列腺炎大鼠射精時間的影響

鄭 濤，王 瑞，張?zhí)鞓耍瑓卫垼Z東輝，楊 帆，張衛(wèi)星

鄭州大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科鄭州450052

慢性前列腺炎(chronic prostatitis，CP)和早泄(premature ejaculation，PE)均為泌尿外科和男科常見病。CP通常表現(xiàn)為尿頻、尿急、尿痛和夜尿增多等排尿癥狀的改變以及骨盆區(qū)域疼痛，在成年男性中發(fā)病率約為8．4%［1］。PE定義為總是或幾乎總是發(fā)生在插入陰道以前或插入陰道的1 min以內(nèi)射精，完全或幾乎完全缺乏控制射精的能力，并造成苦惱、憂慮、挫折和(或)回避性親熱等不良后果。PE影響20%～30%成年男性，可分為原發(fā)性PE和繼發(fā)性PE［2］。CP是最易導致繼發(fā)性 PE 的疾病［3］。雖然CP導致PE的機制尚不清楚，但多認為與前列腺部尿道炎癥以及疼痛有關(guān)。COX-2抑制劑具有較強的抗炎鎮(zhèn)痛作用，能有效緩解CP患者的癥狀，降低 NIH-CPSI評分［4-5］。5-羥色胺(5-hydroxytryptamin，5-HT)是一種重要的中樞神經(jīng)遞質(zhì)，對炎癥、疼痛和性行為都有調(diào)控作用。本研究應(yīng)用自身免疫方法建立CP大鼠模型，觀察了COX-2抑制劑對CP大鼠射精時間的影響，并通過檢測5-HT及其受體水平的變化，對CP合并PE的機制作了初步探討。

1 材料與方法

1．1 實驗動物和主要試劑 SPF級Wistar大鼠90只(體重250～300 g，3～4個月齡)，其中雄性54只，雌性36只，購自河南省實驗動物中心。苯甲酸雌二醇注射液和黃體酮注射液購自天津金耀氨基酸有限公司;完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑和Triton X-100購自美國Sigma公司;BCA蛋白定量試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司;COX-2抑制劑塞來昔布膠囊由輝瑞制藥有限公司提供;5-HT抗體(ab10385)購自美國Abcam公司;5-HT1A抗體(sc-10801)、5-HT2C 抗體(sc-10802)、5-HT 轉(zhuǎn)運體(5-HTT)抗體(sc-13997)購自美國Santa Cruz公司;山羊抗兔鼠通用二抗(HRP)、免疫組化試劑盒和DAB顯色劑購自丹麥 Dako公司;IL-1β和 TNF-α ELISA試劑盒購自美國R＆D Systems公司。

1．2 雄性大鼠分組 雌鼠切除雙側(cè)卵巢2周后，分別在交配實驗前48 h和4 h皮下注射苯甲酸雌二醇20μg和黃體酮500μg(分別用0．1 mL的橄欖油溶解)來誘導雌鼠發(fā)情。造模前1周，每天19:00～21:00進行交配實驗，用昏暗的紅燈照明，調(diào)至可以看清和錄像為止，把雄鼠和發(fā)情狀態(tài)良好的雌鼠1∶1合籠，將連續(xù)5次篩選實驗均表現(xiàn)出性行為的雄鼠視為性功能正常。將篩選出的具有正常性功能的雄鼠隨機分為3組:模型組12只，COX-2抑制劑組10只，正常對照組10只。

1．3 CP大鼠模型的制備和給藥 ①制備大鼠前列腺蛋白提取液:取性功能異常的雄性Wistar大鼠18只，脫脊處死，在無菌條件下剝?nèi)∏傲邢俳M織，稱重后用冷生理鹽水洗凈，加入等體積Triton X-100生理鹽水溶液，在冰水浴上用玻璃勻漿器制成勻漿，4℃ 12 000 r/min離心30 min，取上清液，采用BCA方法測定蛋白質(zhì)濃度，再用0．01 mol/L pH 7．4 PBS將該蛋白提純液濃度調(diào)至60 g/L備用。②制備CP模型:第0天，模型組和COX-2抑制劑組腹側(cè)皮下多點注射大鼠前列腺蛋白提純液和弗氏完全佐劑(用注射器互推法制成比例1∶1)混懸液1 mL。第21天，多點皮下注射大鼠前列腺蛋白提純液和不完全弗氏佐劑(體積比1∶1)混懸液1 mL，以加強免疫。正常對照組于相同時間行皮下多點注射生理鹽水1 mL。③第2次注射蛋白提純液4周后，將大鼠戊巴比妥鈉(35 mg/kg)腹腔注射麻醉，麻醉起效后，取下腹部正中切口，顯露前列腺，仔細觀察后關(guān)閉切口。12只模型組大鼠和10只COX-2抑制劑組大鼠前列腺充血水腫，提示造模成功。造模成功后開始灌胃給藥，COX-2抑制劑組給予塞來昔布(用生理鹽水制成1．8 g/L混懸液)18 mg/(kg·d);模型組和正常對照組給予生理鹽水0．1 mL/(kg·d)，隨體重增加調(diào)整灌胃量。共給藥4周。

1．4 交配實驗 給藥4周后行交配實驗，觀察并記錄大鼠在30 min內(nèi)的交配行為。騎跨潛伏期(mount latency，ML):即從測試開始到雄鼠第1次騎跨雌鼠的時間，有無插入均計數(shù);插入潛伏期(intromission latency，IL):從測試開始到雄鼠有第1次插入的時間;射精潛伏期(ejaculation latency，EL):從雄鼠第1次插入到射精的時間。

1．5 取材 交配實驗后，將大鼠戊巴比妥鈉(35 mg/kg)腹腔注射麻醉，沿胸骨旁線迅速剪開大鼠胸腹腔，穿刺腹腔靜脈，采血3～5 mL，在4℃冰箱放置2 h后2 000 r/min離心15 min，取上清液置于－70℃冰箱保存?zhèn)溆谩ｏ@露心臟，將帶有輸液皮條的粗針頭自心尖向上進針至主動脈起始端，用血管鉗固定針頭，剪開右心耳排液，快速灌注0．1 mol/L PBS。至肝臟變白，自右心耳流出的液體清亮停止灌注。模型組取6只大鼠，正常對照組和COX-2抑制劑組各取5只大鼠，用小止血鉗從背部頭端的椎骨開始仔細咬開棘突和椎板，完整取出脊髓，在冰上切取T13～L2和L5～S2段脊髓分別放入EP管，置于液氮保存。剩余的大鼠接著灌注40 g/L多聚甲醛約300 mL，先快后慢，至大鼠四肢強直僵硬后停止灌注。用上述方法取出T13～L2和L5～S2段脊髓后固定。

1．6 HE染色 上述取材后的大鼠，摘取前列腺組織，生理鹽水洗凈，放入多聚甲醛固定，4℃過夜，石蠟包埋切片，片厚4μm，HE染色后光鏡下觀察。

1．7 ELISA法檢測大鼠血清細胞因子TNF-α、IL-1β的表達 嚴格按試劑盒說明書操作進行檢測。

1．8 脊髓5-HT、5-HT1A、5-HT2C及5-HTT的檢測 ①液氮保存的脊髓標本采用Western blot檢測，利用凝膠分析軟件Image-Plus行蛋白條帶的灰度測定，用目的蛋白條帶的灰度值除以內(nèi)參β-actin的灰度值計算出目的蛋白相對表達量。②多聚甲醛溶液固定的脊髓標本采用免疫組織化學染色方法檢測，每張切片隨機挑選3個200倍視野進行拍照。以棕黃色為染色陽性。應(yīng)用Image-Pro Plus 6．0軟件分析每張照片陽性的累積光密度(IOD)值。

1．9 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19．0進行分析。各組大鼠交配實驗結(jié)果，血清TNF-α和IL-8以及脊髓組織中 5-HT、5-HT1A、5-HT2C、5-HTT表達的比較采用單因素方差分析和SNK-q，檢驗水準α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 前列腺組織形態(tài)學觀察結(jié)果 模型組前列腺腺腔形態(tài)不規(guī)則，腺腔分泌物不均勻，腺上皮出現(xiàn)節(jié)段性壞死，間質(zhì)見大量炎性細胞浸潤。正常對照組未發(fā)現(xiàn)前列腺炎癥。COX-2抑制劑組發(fā)現(xiàn)間質(zhì)少量炎癥細胞浸潤(圖1)。

2．2 各組大鼠交配實驗結(jié)果 COX-2抑制劑組較模型組ML、IL縮短，EL延長，見表1。

2．3 各組大鼠血清 TNF-α、IL-1β結(jié)果 見表2。模型組IL-1β和TNF-α水平顯著高于正常對照組(P ＜0．05)。

2．4 T13～L2和 L5～S2脊髓組織 5-HT、5-HT1A、5-HT2C及5-HTT蛋白的表達 結(jié)果見圖2、3和表3～6。

圖1 各組大鼠前列腺組織形態(tài)學表現(xiàn)(HE，×200)

表1 各組大鼠M L、IL和EL的比較 s

表2 各組大鼠血清TNF-α和IL-1β水平的比較 ng/L

圖2 大鼠T13～L2脊髓組織中5-HT、5-HT1A、5-HT2C及5-HTT的表達

圖3 各組大鼠L5～S2脊髓組織中5-HT、5-HT1A、5-HT2C及5-HTT的表達

表3 各組大鼠T13～L2脊髓組織中5-HT、5-HT1A、5-HT2C及5-HTT表達的比較

表4 各組大鼠L5～S2脊髓組織中5-HT、5-HT1A、5-HT2C及5-HTT的表達

表5 各組大鼠T13～L2脊髓5-HT、5-HT1A、5-HT2C及5-HTT陽性區(qū)域累計IOD比較

表6 各組大鼠L5～S2脊髓5-HT、5-HT1A、5-HT2C及5-HTT陽性區(qū)域累計IOD

3 討論

CP和PE關(guān)系密切，是最易導致繼發(fā)性PE的疾病［3，6］。多數(shù)學者認為PE與前列腺部尿道炎癥以及疼痛有關(guān)。COX-2是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)榍傲邢偎睾推渌傲邢偎匚镔|(zhì)的限速酶，參與疼痛、腫脹、發(fā)熱等炎癥反應(yīng)，特異性COX-2抑制劑可選擇性抑制COX-2的致炎及致痛作用。臨床研究［4-5］證實，COX-2抑制劑能緩解 CP癥狀，降低 NIH-CPSI評分。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠前列腺上皮出現(xiàn)節(jié)段性壞死，間質(zhì)見大量炎性細胞浸潤，呈現(xiàn)典型的前列腺炎表現(xiàn)，而COX-2抑制劑組大鼠前列腺僅間質(zhì)見少量內(nèi)淋巴細胞浸潤，炎癥輕微。交配實驗結(jié)果顯示COX-2抑制劑組EL較模型組明顯延長，與正常組無明顯差異，提示COX-2抑制劑可有效控制前列腺炎癥，且顯著延長CP大鼠射精時間。

5-HT是一種重要的中樞神經(jīng)遞質(zhì)，參與調(diào)節(jié)傷害感受、情感、認知、應(yīng)激反應(yīng)、性行為等多種認知和行為功能，其必須與相應(yīng)的受體結(jié)合才能發(fā)揮生物學效應(yīng)［7］。5-HT對炎癥、疼痛和性行為都有調(diào)控作用。5-HT在射精過程中起著調(diào)控作用，目前發(fā)現(xiàn)有三種受體亞型參與了射精調(diào)控:5-HT1A、5-HT1B和5-HT2C受體。激活5-HT1A受體降低射精閾值，使射精潛伏期縮短，加速射精;與之相反，激活5-HT1B和5-HT2C受體可提高射精閾值，使射精潛伏期延長，延緩射精［7］。另外，5-HT釋放入突觸間隙后，可通過突觸前膜上的5-HTT重新被攝取，從而降低射精閾值，加速射精。選擇性5-HT再攝取抑制劑就是通過降低突觸前膜5-HTT活性達到治療PE的效果［8］。

細胞因子能夠通過p38 Mapk途徑上調(diào)5-HTT的表達和活性，促進5-HT的再攝取，從而降低5-HT水平［9］。Zhang等［10］發(fā)現(xiàn)，5-HT1AmRNA廣泛分布于腰部脊髓灰質(zhì)背角，應(yīng)用角叉菜膠引發(fā)外周炎癥性疼痛后，同側(cè)脊髓灰質(zhì)背角5-HT1A受體mRNA表達升高，8 h后達峰值。Wang等［11］應(yīng)用蜂毒引發(fā)外周炎性疼痛后的1 h和4 h，同側(cè)腰部脊髓灰質(zhì)背角5-HT1A mRNA表達均升高，應(yīng)用反義寡核苷酸技術(shù)敲除大鼠5-HT1A基因，其自發(fā)痛和熱痛敏程度均明顯減輕。研究［1］證實CP可導致機體細胞因子等炎癥指標升高，而且CP的主要癥狀是骨盆區(qū)疼痛，CP也可以引起脊髓5-HT及其受體水平的變化。張述蓉等［12］用免疫組化及RT-PCR法檢測CP大鼠脊髓5-HT及各受體的表達，發(fā)現(xiàn)5-HT在CP大鼠脊髓T13～L2、L3～L4和L5～S1 3個節(jié)段表達均下降。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組血清IL-1β和TNF-α水平升高，T13～L2及L5～S2脊髓5-HT水平下降、5-HT1A水平升高，L5～S2脊髓5-HTT升高，與預(yù)期結(jié)果相符。

已經(jīng)證實前列腺的脊髓控制中樞位于T13～L2和L5～S2［13］，和位于T12～L1的泌精中樞和位于S2～S4的射精中樞［7］有部分重合。作者推測CP導致的脊髓5-HT及其受體水平的變化是CP并發(fā)PE的根本原因。本研究交配實驗結(jié)果顯示，模型組EL較正常對照組顯著縮短;而COX-2抑制劑組前列腺炎癥輕微，細胞因子水平、脊髓5-HT及其受體水平、EL同正常對照組差異無統(tǒng)計學意義，提示COX-2抑制劑可以減輕前列腺炎對脊髓5-HT遞質(zhì)系統(tǒng)的影響，從而延長大鼠射精時間。

綜上所述，CP大鼠EL縮短，與前列腺炎癥所致的脊髓5-HT水平下降、5-HT1A及5-HTT水平升高有關(guān)。COX-2抑制劑可以減輕前列腺炎對脊髓5-HT遞質(zhì)系統(tǒng)的影響，從而延長大鼠射精潛伏期，提示COX-2抑制劑可以用于治療CP所致的繼發(fā)性PE。