沉默FOSL2基因對骨肉瘤MG63細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響

夏先學，陳 路，蔚 芃

川北醫學院附屬醫院骨科四川南充637000

骨肉瘤是兒童和青少年最常見的原發性惡性骨腫瘤，具有高度侵襲性和早期全身轉移的特征［1］。近些年已發現一些分子靶點可明顯改善骨肉瘤患者臨床治療效果，但仍需尋找更多有效靶點。FOS樣抗原2(Fos-related antigen 2，FOSL2)是FOS基因家族成員之一，與Jun亞家族均屬于激活蛋白-1轉錄因子家族，與細胞生長、侵襲和轉移、黏附、運動等有關［2］。多種腫瘤組織內FOSL2表達明顯高于相鄰正常組織。FOSL2可通過與Smad3相互作用促進TGF-β1誘導的非小細胞肺癌遷移［3］;miR-597 靶向FOSL2可抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲和遷移［4］;miR-143-3p靶向FOSL2可抑制骨肉瘤細胞增殖、侵襲和遷移［5］。本研究通過RNAi技術沉默人骨肉瘤細胞MG63細胞中FOSL2表達，旨在探討沉默FOSL2表達對骨肉瘤細胞生長的影響及其機制。

1 材料與方法

1．1 細胞、試劑和儀器 人骨肉瘤MG63細胞株購自美國ATCC。DMEM/F12培養基、胎牛血清均購自美國HyClone;Lipofectamine2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司;CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所;Annexin V-FITC/PI檢測試劑盒購自南京Keygen公司;FOSL2、PCNA、MMP-2和Bax抗體均購自美國Abcam公司;Transwell小室購自美國Costar公司;酶標儀購自美國Bio-Rad公司;流式細胞儀購自德國Eppendorf公司。

1．2 標本來源 收集川北醫學院保存的2016年6月至2018年8月行骨肉瘤穿刺和活檢存檔的骨肉瘤及相應的肉瘤旁正常組織標本，患者中男26例，女16例，年齡8～53歲，中位年齡20歲。所有患者術前均未行放療及化療。

1．3 細胞培養及siRNA轉染 MG63細胞常規復蘇后，用DMEM/F12完全培養基，于體積分數5%CO2、37℃恒溫培養箱常規傳代培養。轉染參照Lipofectamine2000說明。以5×105個/孔密度將生長至對數期的MG63細胞接種于6孔板，每孔2 mL，細胞達30%～50%的生長密度時轉染。細胞分為空白對照組(加生理鹽水)、陰性對照組(NC，轉染陰性對照siRNA)和siFOSL2-siRNA組(轉染FOSL2 siRNA)。制備siRNA和Lipofectamine2000混合液，使siRNA終濃度為100 nmol/L，將混合液加入細胞，于體積分數5%CO2、37℃恒溫條件下轉染4～6 h，換新鮮培養基繼續培養。

1．4 FOSL2、PCNA、MM P-2 和 Bax蛋白的 W estern blot檢測 組織標本液氮冷凍狀態下研磨后或取轉染48 h的MG63細胞，加入適量RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。按照40μg/孔上樣蛋白，經SDS-PAGE、轉膜、封閉后洗膜。PE手套自制雜交袋，將膜放入袋中，加入稀釋好的一抗(FOSL2、PCNA、MMP-2 和 Bax皆按照1∶500稀釋)，室溫搖床孵育2 h，棄一抗，TBST洗膜，在雜交袋中加入按照1∶3 000稀釋的HRP標記的二抗，室溫搖床孵育2 h，TBST洗膜，ECL顯色。Quantity-One軟件分析蛋白條帶灰度值。目的蛋白的相對表達量=目的蛋白灰度值/內參GAPDH灰度值。實驗重復3次。

1．5 細胞增殖實驗 使用CCK-8試劑盒檢測。選擇轉染24 h后生長穩定的骨肉瘤細胞，以1×104個/孔接種于96孔板，每組設置5個復孔。每孔加10μL CCK-8試劑，在體積分數5%CO2、飽和濕度、37℃恒溫培養箱培養，分別于24、48、72和96 h通過酶標儀檢測細胞490 nm波長下的吸光度(A)值。實驗重復3次。

1．6 細胞凋亡實驗 取轉染48 h后生長狀態良好的細胞，棄上清，PBS漂洗2次，加1～2 mL胰蛋白酶消化細胞使之脫壁，靜置5～8 min，輕搖使之形成均勻的細胞懸液，含鈣離子的結合緩沖液終止消化，分別加Annexin V-FITC和PI各5μL，輕搖混勻，再加入結合緩沖液350μL，混勻，常溫避光孵育15 min，上流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1．7 細胞侵襲和遷移實驗 Transwell小室上室加入50μL稀釋好的Matrigel膠，十字搖勻，于37℃培養箱放置40 min。接種轉染48 h后的細胞(3×104個/孔)至Transwell小室的上室，每組設置5個復孔，在上室加100μL無血清培養基，下室加500 μL含血清培養基，37℃密閉培養12 h，取出培養板，結晶紫染色30 min，PBS漂洗2遍，棉簽擦拭掉上層未穿過基底膜的細胞，光鏡下選擇5個視野(×200)，拍照記錄并進行穿膜細胞計數。實驗重復3次。遷移實驗除了未鋪Matrigel膠，其他操作同細胞侵襲實驗。

1．8 MG63細胞PCNA、MMP-2和 Bax m RNA 表達的qRT-PCR檢測 總RNA提取試劑盒提取轉染48 h的MG63細胞總RNA，反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，采用qRT-PCR檢測細胞中PCNA、MMP-2和Bax mRNA的表達。所有引物由上海生工設計合成。PCR反應體系20μL，其中SYBR Premix Ex Tap 10 μL，上下游引物各0．4 μL，模板 cDNA 2 μL，ddH2O 7．2 μL。反應條件95 ℃30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 個循環;65 ℃延長5 min。每個樣品設置3個重復，采用2－ΔΔCt法對數據進行相對定量分析，取均值。

1．9 統計學處理 采用SPSS 21．0進行分析，骨肉瘤和肉瘤旁正常組織FOSL2蛋白表達，采用配對t檢驗，各組細胞增殖、凋亡，侵襲和遷移的差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采SNK-q檢驗，檢驗水準 α =0．05。

2 結果

2．1 骨肉瘤和肉瘤旁正常組織中FOSL2蛋白的表達 42例骨肉瘤和肉瘤旁正常組織中FOSL2蛋白的相對表達量分別為(0．554±0．049)和(0．114±0．012)，兩者比較差異有統計學意義(t配對=15．107，P ＜0．001)，結果見圖1。

圖1 兩種組織FOSL2蛋白的表達

2．2 各組 MG63細胞 FOSL2蛋白的表達FOSL2-siRNA組MG63細胞中FOSL2蛋白表達水平明顯降低(P ＜0．05)，結果見圖2、表1。

圖2 各組MG63細胞中FOSL2蛋白的表達

表1 各組MG63細胞FOSL2蛋白相對表達量比較

2．3 各組MG63細胞增殖情況比較 結果見表2。

表2 各組細胞增殖A值比較(n=3)

2．4 各組MG63細胞凋亡率、侵襲和遷移能力的比較 結果見表3。

表3 各組MG63細胞凋亡率、侵襲細胞數和遷移細胞數的比較(n=3)

2．5 各組MG63細胞中PCNA、MMP-2和Bax的蛋白表達 結果見圖3和表4、5。

圖3 各組MG63細胞PCNA、MMP-2和Bax蛋白的表達

表4 各組MG63細胞中PCNA、MMP-2和Bax m RNA的表達(n=3)

表5 各組MG63細胞中PCNA、MM P-2和Bax蛋白的表達(n=3)

3 討論

近些年分子靶向治療在腫瘤治療中成為研究熱點。FOSL2基因定位于人類2號染色體，在脂肪代謝、骨發育、系統硬化癥、癌癥等疾病中均發揮重要作用［6］。皮膚T淋巴細胞瘤中FOSL2表達量極高，RNAi技術介導的FOSL2敲除可抑制癌細胞的生長及CCR4和 MYB等致癌基因的表達［7］。已有研究［5］表明miR-143-3p可靶向FOSL2抑制骨肉瘤細胞增殖、侵襲和遷移。本研究結果顯示，抑制FOSL2表達后骨肉瘤MG63細胞增殖、侵襲和遷移能力明顯降低，且凋亡率明顯升高，提示FOSL2在骨肉瘤的發生發展中有重要作用。

PCNA是一種可反映細胞增殖程度的理想指標，其表達水平可客觀反映腫瘤細胞的增殖狀態［8］。有研究［9-10］證實，PCNA 高表達的骨肉瘤患者臨床預后差。MMP是一類重要的蛋白酶類，與腫瘤生長、侵襲和轉移密切相關，MMP-2是MMP家族成員之一。有研究［11］顯示，MMP-2在骨肉瘤等多種腫瘤中表達升高，可促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。Bax是與凋亡相關的Bcl-2家族成員之一，多項研究［12-13］表明，Bax表達上調對骨肉瘤細胞凋亡起促進作用。本研究結果顯示，抑制FOSL2表達的骨肉瘤細胞中PCNA和MMP-2表達明顯降低，Bax表達明顯升高，提示FOSL2對骨肉瘤細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡影響與調控 PCNA、MMP-2和 Bax表達有關。

綜上所述，FOSL2與骨肉瘤細胞活力、侵襲和遷移能力關系密切，機制與下調PCNA、MMP-2表達及上調Bax表達有關。