上調(diào)抗增殖蛋白表達對TNF-α誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞損傷的影響

張 杰，劉 亮，周 輝，郭桂喜，于 強，銀鵬飛，陳文強，蘇 興)

1)北大醫(yī)療魯中醫(yī)院心血管內(nèi)科山東淄博255400 2)北京大學(xué)國際醫(yī)院心內(nèi)科北京102200 3)山東大學(xué)齊魯醫(yī)院心內(nèi)科濟南250012

急性心肌梗死嚴(yán)重影響人類的生命健康。炎癥反應(yīng)是心肌損傷發(fā)生的重要原因，心肌梗死后的炎癥反應(yīng)可以促進心力衰竭等的發(fā)生［1-2］。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是機體內(nèi)關(guān)鍵的炎癥因子，在心力衰竭、動脈粥樣硬化等心血管系統(tǒng)疾病中發(fā)揮促進作用，能夠誘導(dǎo)心肌細胞損傷［3-4］。抗增殖蛋白(prohibitin，PHB)是一種核基因編碼的蛋白質(zhì)，具有維持心肌細胞正常功能、減少心肌細胞凋亡的作用［5］。研究［6］表明，過表達PHB具有保護高糖誘導(dǎo)心肌細胞的作用。本實驗以心肌細胞H9c2為研究對象，通過構(gòu)建TNF-α心肌細胞炎癥損傷模型，探討PHB在心肌細胞炎癥損傷中的作用，為明確心肌損傷發(fā)生機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料 心肌細胞H9c2購自武漢普諾賽生命科技有限公司;PHB上游引物序列 :5’-GGAG GCGTGGTGAACTCTG-3’，下游引物序列:5’-CTG GCACATTACGTGGTGGAG-3’;GAPDH上游引物序列:5’-CTGTTGCTGTAGCCAAATTCGT-3’，下游引物序列:5’-CTGTTGCTGTAGCCAAATTCGT-3’;引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計并合成。過表達PHB的慢病毒(Lv-PHB)和陰性對照慢病毒(Lv-NC)由南京科佰生物科技有限公司構(gòu)建;重組TNF-α購自美國Thermo公司;SYBR Green Realtime PCR試劑盒購自上海索萊寶生物科技有限公司;活化型 Caspase-3(Cleaved Caspase-3)抗體、CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein C/EBP，CHOP)抗體、活化型Caspase-12(Cleaved Caspase-12)抗體購自美國CTS公司;PHB抗體購自武漢福來生物工程有限公司;乳酸脫氫酶(LDH)含量檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1．2 細胞培養(yǎng)及分組處理 心肌細胞H9c2在37℃體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中用含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，當(dāng)H9c2細胞密度為40%時，在細胞中添加Lv-PHB和Lv-NC病毒液(MOI=10)，繼續(xù)培養(yǎng)12 h以后，吸棄病毒液，加入新鮮的細胞培養(yǎng)液，3 d后，用1 mg/L的嘌呤霉素篩選(5 d)。用qRT-PCR和 Western blot檢測細胞中 PHB的表達，評估感染效率。取感染Lv-PHB和Lv-NC的H9c2細胞，用含有20μg/L的TNF-α細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h作為 Lv-PHB+TNF-α組和 Lv-NC+TNF-α組，以未感染且不用TNF-α處理的H9c2細胞作為對照組，以未感染、僅用20μg/L的 TNF-α細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h的H9c2細胞作為TNF-α組。

1．3 qRT-PCR檢測細胞中PHB m RNA的表達

取上述4組細胞，吸除上清液，添加Trizol裂解液，按照細胞RNA提取試劑盒操作說明提取RNA。用DEPC水溶解RNA并分裝，－80℃冰箱保存用于后續(xù)實驗。取適量RNA，用cDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，cDNA在－80℃中保存。取cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，采用SYBR Green Realtime PCR試劑盒進行擴增。PCR反應(yīng)體系:2．5×Real Master Mix/SYBR 液9．0 μL，上、下游引物各0．4 μL，cDNA 1μL，超純水9．2μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min;95℃變性15 s，62℃退火30 s，68℃延伸30 s，共38個循環(huán)。按照2－ΔΔCt方法計算PHB mRNA表達水平。實驗重復(fù)3次。

1．4 W estern blot檢測細胞中PHB蛋白的表達取上述4組細胞，在細胞中添加含有PMSF的細胞裂解液，離心后吸取上清，－80℃保存。按照BCA法對蛋白進行定量。按照常規(guī)方法配制分離膠和濃縮膠，上樣量40 μg，設(shè)置電泳為恒壓90 V，2．5 ～3 h后取出凝膠，在冰水混合物上進行轉(zhuǎn)膜(約60 min，轉(zhuǎn)膜電流200 mA)。把轉(zhuǎn)膜后的NC膜放在50 g/L牛血清白蛋白中孵育2 h，加PHB一抗(按1∶800稀釋)，4℃搖床過夜，再與二抗(按1∶2 000稀釋)室溫結(jié)合2 h，ECL發(fā)光。最后用Quantity One軟件對蛋白條帶進行定量，以GAPDH作為內(nèi)參，分析蛋白表達水平。實驗重復(fù)3次。

1．5 M TT檢測細胞的增殖活性 將H9c2細胞種植到96孔板內(nèi)，按照1．2分組處理，培養(yǎng)24 h后取出培養(yǎng)板，每孔添加20μL MTT，孵育4 h。吸除上清液，添加150μL DMSO，待結(jié)晶物溶解以后，檢測490 nm波長的吸光度(A)。細胞存活率=實驗組A/對照組A×100%。實驗重復(fù)3次。

1．6 比色法檢測細胞LDH漏出率 收集4組細胞培養(yǎng)液上清和細胞，分別檢測LDH含量，步驟同LDH含量檢測試劑盒。LDH漏出率=上清中LDH含量/(上清中LDH含量+細胞中LDH含量)×100%。實驗重復(fù)3次。

1．7 雙染法檢測細胞的凋亡情況 收集4組細胞，吸棄上清溶液，胰蛋白酶消化成單細胞懸液，添加PBS將細胞懸浮以后，繼續(xù)加入400μL結(jié)合緩沖液，添加PI和Annexin V-FITC各5μL，在60 min內(nèi)用流式細胞儀檢測。實驗重復(fù)3次。

1．8 W estern blot檢測細胞中 Cleaved Caspase-3、CHOP、Cleaved Caspase-12蛋白的表達 收集4組細胞，用 Western blot方法檢測細胞中 Cleaved Caspase-3、CHOP、Cleaved Caspase-12 蛋白的表達水平，步驟同1．4。實驗重復(fù)3次。

1．9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21．0進行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用單因素方差分析和SNK-q檢驗比較4組心肌細胞中PHB表達、細胞存活率、LDH漏出率、凋亡率、細胞中Cleaved Caspase-3、CHOP和Cleaved Caspase-12蛋白表達的差異，檢驗水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 4組心肌細胞中PHB的表達 見表1。由表1可知，與對照組比較，TNF-α組細胞中PHB表達下調(diào)，Lv-PHB+TNF-α組細胞中PHB蛋白和mRNA表達水平均較TNF-α組升高。

表1 4組心肌細胞中PHB表達的比較(n=3)

2．2 4組心肌細胞存活率、LDH漏出率的比較

見表2。由表2可知，與對照組比較，TNF-α組細胞存活率降低，LDH漏出率升高;與TNF-α組比較，Lv-PHB+TNF-α組細胞存活率升高，LDH漏出率降低。

表2 4組心肌細胞存活率、LDH漏出率比較(n=3)

2．3 4組心肌細胞凋亡率及Cleaved Caspase-3蛋白表達水平比較 見表3。由表3可知，與對照組比較，TNF-α組細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3蛋白表達水平升高;與TNF-α組比較，Lv-PHB+TNF-α組細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3蛋白表達水平降低。

表3 4組心肌細胞凋亡率及Cleaved Caspase-3蛋白表達水平比較(n=3)

2．4 4組心肌細胞中CHOP和Cleaved Caspase-12蛋白表達水平比較 見表4。由表4可知，與對照組比較，TNF-α組細胞中 CHOP和 Cleaved Caspase-12蛋白表達水平升高;與TNF-α組比較，Lv-PHB+TNF-α組細胞中 CHOP和 Cleaved Caspase-12蛋白表達水平降低。

表4 4組心肌細胞中CHOP和Cleaved Caspase-12蛋白表達水平比較(n=3)

3 討論

TNF-α是機體內(nèi)重要的促炎癥因子，其在心肌缺血再灌注、心力衰竭等過程中過度表達［7-8］，巨噬細胞、心肌細胞、成纖維細胞等多種類型的細胞均可以分泌TNF-α，該細胞因子參與細胞生長、凋亡等過程。研究［9］表明，TNF-α誘導(dǎo)的心肌細胞損傷是心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生的重要原因。本實驗結(jié)果表明，經(jīng)TNF-α處理后，心肌細胞存活率降低，LDH漏出率升高，提示TNF-α誘導(dǎo)了心肌細胞損傷，這與之前的研究結(jié)果相符合。

PHB定位于12q13染色體上，其主要在線粒體、細胞核內(nèi)表達，參與調(diào)控細胞的生長、凋亡、衰老等過程［10］。在缺血再灌注損傷的兔心肌細胞線粒體中PHB表達下調(diào);過量的PHB可以減少H2O2誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡，提高心肌細胞活性［5］。PHB還拮抗糖尿病心肌細胞損傷過程，過表達PHB可以減少高糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡;PHB高表達參與了AG490 減輕缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷［6，11-12］。本實驗結(jié)果顯示，PHB表達上調(diào)后經(jīng)TNF-α處理的心肌細胞增殖活性升高，LDH漏出率降低，細胞凋亡率也降低，表明PHB具有減輕TNF-α對心肌細胞損傷的作用，其機制可能與減少心肌細胞凋亡有關(guān)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的細胞凋亡與非折疊蛋白反應(yīng)、鈣離子起始信號等有關(guān)，CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激元件基因，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時高表達，CHOP表達上調(diào)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的直接結(jié)果［13］。Caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)生的主要因素，其定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的胞漿面，可以被鈣離子平衡破壞、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中過量蛋白沉積等引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活，其在非內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡中不活化［14］。Caspase-12酶原活化后形成 Cleaved Caspase-12，誘導(dǎo)活化Caspase凋亡途徑，最終導(dǎo)致Caspase-3的活化，而Caspase-3活化是細胞凋亡進入不可逆階段的標(biāo)志之一［15］。本實驗結(jié)果顯示，上調(diào)PHB表達可以降低TNF-α處理的心肌細胞中 CHOP和 Cleaved Caspase-12、Cleaved Caspase-3表達水平，提示 PHB可能通過降低心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平發(fā)揮保護作用，其具體的靶向作用位點尚不明確，在以后的實驗中會進行探討。

總之，上調(diào)PHB表達可以減輕TNF-α對心肌細胞的損傷。本實驗沒有在原代心肌細胞中進行驗證，對于其具體的調(diào)控機制尚未研究，在以后的實驗中會對上述不足部分進行探討。