m iR-451對類風濕關節炎患者外周血單個核細胞增殖及炎癥反應的影響

熊金河，吳 霞，茍玉瀟

遂寧市中心醫院風濕免疫科四川遂寧629000

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性系統性自身免疫性疾病，表現為多關節的滑膜慢性炎癥［1］。microRNA(miRNA)是由21 ～24 個核苷酸組成的非編碼短鏈內源性單鏈微小RNA，參與基因表達的調控［2］，在多種生理過程中發揮重要作用［3-4］，與多種疾病的發生發展關系密切，包括癌癥、自身免疫性疾病、神經退行性疾病及心血管疾病等［5］。近年來，眾多學者［6-7］報道了RA 患者和動物模型中異常表達多種 miRNA。體外研究［8］表明，miR-451可以在一定條件下調節樹突狀細胞細胞因子的分泌能力。本研究對RA患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中 miR-451的表達進行了檢測，并觀察過表達miR-451、激活NF-κB信號通路對RA患者PBMC細胞增殖、炎癥反應的影響，揭示 miR-451、NF-κB信號通路與RA的關系。

1 材料與方法

1．1 材料 RPMI 1640培養基、胎牛血清、MTT均購自上海碧云天生物技術有限公司;Lipofectamine2000、BCA蛋白定量試劑盒、RNA抽提試劑盒、反轉錄試劑盒、ECL發光液和RIPA裂解液購自大連TaKaRa公司;miR-451模擬物(mimics)及模擬物陰性對照物(NC)購自廣州市銳博生物科技有限公司;qRT-PCR試劑盒購自上海欽誠生物科技有限公司;人白介素17(IL-17)、IL-1β、IL-6檢測試劑盒均購自上海恒遠生物科技有限公司;PVDF膜購自德國羅氏診斷有限公司;NF-κB信號通路特異性激活劑TNF-α購自上海艾博抗公司。

1．2 PBMC的分離培養 選取在我院通過28個關節疾病活動指數(disease activity score 28 joint，DAS28)、臨床疾病活動指數(clinical disease activity index，CDAI)、簡化疾病活動指數(simplified disease activity index，SDAI)確診為低活動度RA的患者20例，患者在1個月內均未服用免疫抑制劑或糖皮質激素類藥物。另選取同期健康志愿者5人。空腹抽取受試者靜脈血，肝素抗凝，參考安燕等［9］的方法分離全血中的PBMC，用含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基于37℃、體積分數5%CO2培養箱中常規培養。將分離的健康志愿者和RA患者的PBMC分別記為正常PBMC、RA-PBMC。

1．3 實驗分組 將RA-PBMC分為對照組(正常培養)、miR-451組(轉染 miR-451 mimics)、miR-NC 組(轉染 NC)、miR-451+TNF-α 組(用 10 μg/L 的TNF-α處理轉染 miR-451 mimics的 RA-PBMC 24 h)。轉染操作均按照脂質體Lipofectamine2000試劑盒說明書進行，轉染8 h后，更換新鮮培養基繼續培養48 h。

1．4 觀察指標

1．4．1 細胞中miR-451的表達 采用qRT-PCR法檢測。收集細胞并調整密度至106個/mL，取1 mL用RNA抽提試劑盒提取總RNA，然后用反轉錄試劑盒合成cDNA;以cDNA為模板進行PCR。按照PCR試劑盒的要求操作，以U6作為內參。配制20 μL的反應體系:依次添加 10μL的2×SYBRmix，上、下游引物各 1 μL，1 μL的 cDNA、7 μL的ddH2O，充分混勻。反應條件為95℃30 s，95℃ 15 s，72 ℃ 15 s，進行 40 個循環。用 2－ΔΔCt計算 miR-451的相對表達水平。miR-451上游引物序列5’-GCGGCGCAAAGAATTCTCCT-3’，下游引物序列 5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’;U6上游引物序列5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，下游引物序列5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。

1．4．2 細胞增殖抑制率 采用MTT法檢測。收集細胞并調整密度至104個/mL，接種至96孔板，每孔加MTT溶液(5 g/L)20μL，孵育4 h，終止培養，棄去培養液上清，每孔加150μL DMSO，振蕩使結晶充分溶解，在490 nm波長下檢測吸光度(A)。細胞增殖抑制率=［1－樣品A/空白A］×100%。

1．4．3 細胞中 IL-17、IL-1β、IL-6的表達 采用ELISA法檢測。收集細胞，于4℃12 000 r/min離心10 min，取上清，按照試劑盒要求檢測 IL-17、IL-1β、IL-6的含量。

1．4．4 細胞中 P65、P52、P50、IκBα 蛋白的表達

采用Western blot法檢測。將對數生長期的細胞用2．5 g/L胰蛋白酶緩慢消化，然后收集細胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r/min離心10 min，取上清置于EP管，加入5×SDS上樣緩沖液，沸水煮沸10 min。將配制好的濃縮膠和分離膠分別緩緩傾倒凝固后，進行穩壓和穩流電泳。電泳結束后用轉膜儀將蛋白轉移至PVDF膜，用50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，洗膜，加入兔抗人P65或P50多克隆抗體(1∶500，圣克魯斯生物公司)、P52多克隆抗體(1∶1 000，上海研盟生物公司)、IκBα 多克隆抗體(1∶500，艾美捷科技公司)和GAPDH單克隆抗體(1∶1 000，上海碧云天生物技術有限公司)，4℃過夜孵育，洗膜，加辣根過氧化物酶標記的IgG抗體，4℃ 2 h。ECL發光，曝光。用凝膠成像系統采集圖像，用Image J分析條帶灰度值，以目的條帶與內參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

1．5 統計學處理 采用SPSS 21．0進行數據分析。正常PBMC和RA-PBMC上述指標的比較采用兩獨立樣本的t檢驗;4組上述指標的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗;檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 RA-PBMC中m iR-451、炎癥因子的表達及增殖抑制率的比較 見表1。RA-PBMC細胞增殖抑制率，miR-451及 IL-17、IL-1β、IL-6表達均高于正常PBMC(P ＜0．05)。

表1 正常PBMC和RA-PBMC中m iR-451、炎癥因子表達及增殖抑制率的比較

2．2 TNF-α 對過表達 m iR-451的 RA-PBMC 中m iR-451炎癥因子表達及增殖抑制率的影響 見表2。與對照組和miR-NC組相比，miR-451組細胞中miR-451表達、細胞抑制率升高，IL-17、IL-1β、IL-6表達降低(P＜0．05)。與miR-451組比較，miR-451+TNF-α組miR-451表達和細胞增殖抑制率降低，IL-17、IL-1β、IL-6 的表達均升高(P ＜0．05)。

表2 4組細胞中m iR-451、炎癥因子表達及細胞增殖抑制率的比較(n=9)

2．3 TNF-α 對過表達 m iR-451的 RA-PBMC 中P65、P52、P50及IκBα蛋白表達的影響 見圖1和表3。與對照組和miR-NC組相比，miR-451組細胞中 P65、P52、P50 蛋白表達均下調，IκBα 蛋白表達上調(P＜0．05)。與miR-451組相比，miR-451+TNF-α 組細胞中 P65、P52、P50蛋白表達上調，IκBα 蛋白表達下調(P ＜0．05)。

圖1 4組細胞中P65、P52、P50及IκBα蛋白的表達

表3 4組細胞中P65、P52、P50及IκBα蛋白的表達(n=9)

3 討論

miRNA在人類多種疾病的發生發展中均具有調控作用，包括癌癥、自身免疫疾病、神經退行性疾病及心血管疾病等［5］。有研究［10］報道 miR-451在關節痛患者中的表達異常升高。Churov等［11］報道，RA患者血清miR-451表達水平升高，有可能成為RA的早期診斷指標。Wang等［12］報道，過表達miR-451的滑膜成纖維細胞增殖能力降低，細胞上清液中 TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平降低，并認為miR-451通過下調P38 MAPK的表達而降低滑膜成纖維細胞的增殖能力和炎癥細胞因子的表達。

NF-κB是由Rel蛋白家族成員之間相互作用構成的一種二聚體，又稱Rel同源結構域。在哺乳動物中，Rel蛋白包括 RelA(P65)、RelB、c-Rel、NF-κB2(P52)、NF-κB1(P50)［13-14］。大量研究［15-16］報道，NF-κB信號通路在RA炎癥反應過程中異常激活，促進了病情的發展，miR-125b、miR-138和LncRNA HOTAIR均可通過NF-κB信號通路調節RA的進展。

本研究結果顯示，RA患者PBMC細胞中miR-451高表達，與Churov等的實驗結果相一致;過表達miR-451可明顯減弱RA患者PBMC細胞的增殖能力和炎癥因子的分泌，這說明miR-451對RA患者PBMC細胞也具有調節作用。本研究結果還顯示，過表達miR-451可下調RA患者PBMC中NF-κB信號通路相關蛋白 P65、P52、P50的表達，上調 IκBα的表達，提示過表達miR-451抑制了RA患者PBMC中NF-κB信號通路，推測miR-451對RA患者PBMC細胞增殖、炎癥反應的調控可能與該通路相關。進一步研究發現，利用TNF-α激活NF-κB信號通路后，過表達miR-451的RA患者PBMC細胞中miR-451的表達明顯下調，細胞增殖抑制率也降低，細胞中炎癥因子的表達上調，這說明激活NF-κB信號通路可抑制miR-451的表達，從而增強了RA患者PBMC細胞的殖能力，調節炎癥因子的表達。

綜上所述，miR-451可抑制RA患者PBMC的增殖能力和炎癥反應，其機制與NF-κB信號通路失活有關，miR-451有可能成為RA治療的靶點。