新城疫病毒熒光RT-PCR檢測方法的建立

郭瑩瑩 王世狀

（黑龍江省前進(jìn)農(nóng)場 156331）

新城疫是由新城疫病毒起地對家禽養(yǎng)殖業(yè)危害較大的一種傳染性疾病。該病毒傳播速度快，比較難控制，是檢驗(yàn)檢疫中要求嚴(yán)格檢驗(yàn)控制的一種病毒。PCR 技術(shù)克服了傳統(tǒng)的病原分離及常規(guī)血清學(xué)診斷等方法的費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、敏感性和特異型較差的缺點(diǎn)，已被應(yīng)用與多種病原微生物的鑒定和檢測。為了適應(yīng)活禽、禽肉制品中，快速、特異的特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用“新城疫病毒熒光RT-PCR 檢測試劑盒”，建立快速檢測NDV 的熒光RT-PCR 方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

RT-PCR 新城疫診斷試劑盒由北京出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心和深圳市匹基生物工程股份有限公司聯(lián)合生產(chǎn)。

試劑：PBS 溶液、氯仿、無水乙醇、異丙醇。

樣品A：新城疫病毒，分離自接種病毒雞體。

樣品B：新城疫標(biāo)準(zhǔn)陰性對照，來自試劑盒。

樣品CDEFG：新城疫疑似病毒，分離自農(nóng)戶家甲、乙、丙、丁、戊病死雞體。

樣品H：新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽性對照，來自試劑盒。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

小型離心機(jī)、混勻器、冰箱（4℃，-20℃）、熒光PCR 檢測儀、臺(tái)式高速離心機(jī)、吸頭、1.5mL 滅菌離心管、移液器、記號筆、吸水紙、微量板、鑷子。

1.3 方法

1.3.1 病毒RNA 的提取

（1）分別向每瓶樣品中加入2mLPBS 溶液，使其充分溶解。

（2）取8 個(gè)1.5ml 滅菌離心管，做好標(biāo)記。

（3）每個(gè)離心管加入600μL 裂解液，然后分別加入待測樣品、陰陽對照各200μL； 再加入氯仿200μL，混勻器上振蕩混勻5s。

（4）在4℃條件下，12000g 離心15min。

（5）取與步驟1 中相同數(shù)量的1.5ml 離心管，加入400μL異丙醇（-20℃預(yù)冷），做好標(biāo)記。吸取步驟4 各管中的上清液相轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，顛倒混勻。

（6）12000g 離心15min。輕輕倒去上清，倒置于濾紙上，沾干液體； 加入75%乙醇600μL，顛倒洗滌。

（7）12000g 離心10min。輕輕倒去上清，倒置于上吸水紙上，盡量沾干液體。

（8）4000g 離心15min。將管壁上的殘余液體甩到管底部，用微量加樣器盡量將其吸干，室溫干燥3min。

（9）加入11μL DEPC 水輕輕混勻，溶解管壁上的RNA，2000g 離心5s，冰上保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備

（1）從試劑盒中取出相應(yīng)的RT-PCR 反應(yīng)液，Taq 酶，在室溫下融化后，在2000r/min 離心5s，則所需的PCR 數(shù)為16，每個(gè)測試體系配制如下，把RT-PCR 反應(yīng)液和Taq 酶按每個(gè)PCR 反應(yīng)管加15μL 的PCR 和1/4 顆（即一顆加4 個(gè)孔）的比例配成反應(yīng)液。

（2）把試劑盒中的PCR 板條取出，放在微量板上，在各設(shè)定的PCR 板條管中分別加入上述病毒提取步驟（9）中制備的RNA 溶液各10μL，蓋緊管，使用臺(tái)式離心機(jī)在17℃下9600g離心20min，取出板條，放入熒光PCR 熒光檢測儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。

（3）循環(huán)條件設(shè)置。

表1 PCR 循環(huán)條件程序

儀器檢測通道選擇F1 通道

（4）結(jié)果分析條件設(shè)定

讀取F1 通道的檢測結(jié)果。閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，結(jié)果顯示陰性為準(zhǔn)，或可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。

2 判定依據(jù)

CT 值無數(shù)值的為陰性，CT 值≤40.0 的樣本為陽性樣本。同時(shí)，陰性對照的檢測結(jié)果為陰性，陽性對照的檢測結(jié)果為陽性。

3 結(jié)果

熒光RT-PCR 儀對試驗(yàn)樣品的檢測結(jié)果見表2 和附圖。

從表2 和附圖可以看出，接種的新城疫病毒，新城疫陽性（試劑盒）為陽性，因?yàn)橹灰顷栃跃陀袑?shù)增長期。所選的幾種疑似病例中以農(nóng)戶家里的曲線走的好，從圖上的順序來看，其曲線中較高的一條（C1）高于新城疫接種病毒的較低的一條（A2）。其兩條曲線（C1，C2）均高于新城疫陽性對照（H1，H2），這說明它是致病性較強(qiáng)的毒株。而樣品D、E、F、G 均為陰性。從本試驗(yàn)中可以得出，疑似病例中只有農(nóng)戶家甲為強(qiáng)毒株，而由其他農(nóng)戶家的疑似病例產(chǎn)生的新城疫病毒均為弱毒株或無毒性。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

通過采用RT-PCR 方法來檢測新城疫病毒毒性強(qiáng)弱程度的同時(shí)發(fā)現(xiàn)，該檢測方法具備了多項(xiàng)操作優(yōu)勢：

（1）快速：與雞胚病毒分離方法相比，在時(shí)間上來講，從至少需要21d 縮短為4h；

（2）靈敏：針對感染性雞胚尿囊液，人工感染SPF 雞等方面有與雞胚病毒分離方法的敏感性基本一致；

（3）準(zhǔn)確：與雞胚病毒分離相比，特異性基本一致；閾值為：0.172

表2 熒光RT-PCR 對試驗(yàn)樣品的檢測結(jié)果

附圖 試驗(yàn)樣品的熒光RT-PCR 圖

（4）操作簡單：本試劑盒給檢測者提供了質(zhì)量優(yōu)異的試劑及優(yōu)化的操作程序，經(jīng)過簡單的培訓(xùn)，檢測者可勝任該項(xiàng)工作。