倒置顯微鏡觀察MDCK細胞分離流感病毒過程中的狀態變化

鄭梅 梁廣忠 趙曉萌 孫雅娜 趙穎 楊振河

摘要：目的? 探討倒置顯微鏡下觀察狗腎上皮細胞（MDCK）分離流感病毒狀態變化，為科學防控流感提供技術支持。方法? 選取天津市津南區疾病預防控制中心流感網絡實驗室于2018年10月11日～20日流感病毒檢測陽性的咽拭子樣本20例，接種到MDCK傳代細胞中，于接種后使用倒置顯微鏡觀察細胞形態變化，包括細胞腫脹、間隙增大、核固縮或破裂、細胞部分或全部脫落，用血凝實驗方法測定MDCK細胞不同分離狀態下的流感病毒滴度狀況。結果? 倒置顯微鏡可以觀察到MDCK細胞分離流感病毒狀態的變化，陰性對照與未出現倒置顯微鏡鏡下病變的MDCK細胞不能使人“O”型紅細胞凝集;出現病變的MDCK細胞可以使人“O”型紅細胞凝集，產生HA滴度。結論? 倒置顯微鏡在觀察MDCK細胞分離流感病毒過程中起到重要作用，可提前判斷病毒的滴度與活力，為科學防控流感提供技術支持。

關鍵詞：倒置顯微鏡;流感病毒;MDCK細胞

中圖分類號：R373.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.16.055

文章編號：1006-1959（2019）16-0163-02

Abstract：Objective? To investigate the changes of influenza virus status in dog kidney epithelial cells （MDCK） under inverted microscope and provide technical support for scientific prevention and control of influenza. Methods? 20 cases of swallow swab samples with positive influenza virus detection were selected from the influenza network laboratory of Tianjin Jinnan District Center for Disease Control and Prevention from October 11 to 20， 2018. They were inoculated into MDCK passage cells and observed under inverted microscope after inoculation. Cell morphology changes， including cell swelling， gap enlargement， nuclear pyknosis or rupture， partial or total detachment of cells， blood clotting experiments were used to determine the influenza virus titer status of MDCK cells under different separation conditions. Results? Inverted microscope can observe the changes of MDCK cells in the state of influenza virus isolation. Negative control and MDCK cells without inverted microscopic lesions cannot agglutinate human "O" type red blood cells; MDCK cells with lesions can make human "O" type Red blood cells aggregate to produce HA titers. Conclusion? Inverted microscope plays an important role in the observation of MDCK cells in the isolation of influenza virus. It can judge the titer and vitality of virus in advance and provide technical support for scientific prevention and control of influenza.

Key words：Inverted microscope;Influenza virus;MDCK cells

流行性感冒（influenza），簡稱流感，是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，具有高度傳染性，可在人群中引起流行，是第一個實行全球監測的傳染性疾病，多次引起世界性大流行[1]。主要傳染源為流感患者和隱性感染者，飛沫傳播為主要傳播途徑。其臨床表現為急起高熱、全身疼痛、顯著乏力和輕度呼吸道癥狀。流感不僅會引起呼吸系統的損害，不及時治療還可累及心血管、神經等系統。目前流感監測主要以狗腎上皮細胞（Madin-Darby canine kidney cell，MDCK）分離培養為主，是流感病毒檢測的金標準[2]。流感病毒MDCK細胞分離培養的質量直接關系到流感監測效果，能否高效的分離流感病毒是流感監測的工作重點，也是流感病毒進行抗原分析和耐藥分析的實驗基礎[3]。流感病毒MDCK細胞的分離狀態觀察主要依賴于倒置顯微鏡。本研究主要通過使用倒置顯微鏡觀察流感病毒在MDCK細胞上的分離狀態變化，為科學防控流感提供技術支持，現報道如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器? 倒置顯微鏡，品牌型號為Nikon Eclipse TS100。

1.1.2試劑? DMEM培養基、胎牛血清、0.25% EDTA胰酶、HEPES、青鏈霉素、TPCK胰酶、人“O”型紅細胞。

1.1.3細胞培養液成分? DMEM培養基，8.5%胎牛血清，青霉素、鏈霉素、HEPES終濃度分別為100 U/ml、100 μg/ml、25 mmol/L，用 NaHCO3將pH值調整為7.0左右。

1.1.4流感病毒? 由天津市津南區疾病預防控制中心流感網絡實驗室2018年10月11日～20日接收的流感樣病例咽拭子樣本經實時熒光定量PCR檢測結果為陽性的咽拭子樣本20例。

1.2方法? MDCK細胞瓶制備22瓶MDCK傳代細胞備用。將流感病毒液接種MDCK細胞瓶內，置于35℃、5% CO2培養箱培養吸附2 h，吸去病毒液，用DMEM維持液洗一遍，每瓶加入5 ml DMEM維持液，置于35℃、5% CO2培養箱培養。維持液成份：MDEM培養基，青霉素、鏈霉素、HEPES、TPCK胰酶終濃度分別為100 U/ml、100 μg/ml、25 mmol/L、2 μg/ml，用 NaHCO3將pH值調整為7.2左右。

1.3觀察指標? 倒置顯微鏡下觀察MDCK細胞分離流感病毒狀態變化，分別取陰性對照、未出現病變的和病變出現的細胞培養上清液，用血凝實驗測定病毒的血凝素抗原（HA）滴度。

2結果

2.1 MDCK細胞分離流感病毒狀態變化? 在倒置顯微鏡下觀察細胞病變，陰性對照（圖1）生長成片的MDCK細胞，成多邊型;接種流感病毒但未出現病變的MDCK細胞（圖2）生長狀態與陰性對照類似;接種流感病毒出現明顯細胞病變的MDCK細胞：細胞圓縮成圓形，折光性增強、細胞核固縮、碎片增多，直至成片脫落，僅存少量細胞生長于瓶底。病毒接種時間不同則細胞病變的程度不同。

2.2血凝實驗結果? 陰性對照與未出現倒置顯微鏡鏡下病變的MDCK細胞不能使人“O”型紅細胞凝集;出現病變的MDCK細胞可以使人“O”型紅細胞凝集，產生HA滴度。

3討論

倒置顯微鏡能夠供高校科研實驗、醫療衛生單位等部門使用，可以用于細胞、微生物、細菌、組織培養、沉淀物、懸浮體等的觀察，能夠連續觀察并拍攝記錄細菌等生物在培養液中繁殖分裂的過程，在免疫學、細胞學、遺傳工程學、腫瘤學、寄生蟲學、工業 微生物學、植物學等各個領域發揮十分重要的作用[4]。

流感病毒最外層是HA，能與人、豚鼠、鳥等動物紅細胞表面的受體相結合引起凝血[5]，可以通過血凝實驗判斷培養物中是否存在流感病毒，HA滴度與流感病毒的多少呈正相關。流感病毒主要用MDCK細胞分離培養，為溶細胞型病毒，在感染細胞后，細胞開始凋亡，凋亡的細胞會從吸附的表面掉落，MDCK細胞細胞膜破裂，大量的流感病毒釋放到培養上清液中，造成在血凝實驗中測得到培養物上清液的良好HA滴度。HA滴度可以反映出病毒的毒力，而毒力決定其侵襲正常細胞的能力，病毒的毒力可以反映出病毒的復制能力。而流感病毒感染細胞后，細胞的凋亡過程可以使用倒置顯微鏡觀察，根據鏡下的狀態可以預先判斷細胞分離流感病毒的狀況。

本研究通過使用倒置顯微鏡對MDCK傳代細胞進行流感病毒接種觀察細胞狀態變化，可以驗證MDCK細胞對流感病毒分離較敏感，分離過程細胞的狀態可使用倒置顯微鏡觀察，包括細胞腫脹、間隙增大、核固縮或破裂、細胞部分或全部脫落。本研究中觀察到的細胞凋亡狀況與血凝實驗滴度結果相吻合，陰性對照細胞沒有檢測出流感病毒滴度，細胞脫落的程度與流感病毒血凝滴度的檢出成正比。

綜上所述，倒置顯微鏡在觀察MDCK細胞分離流感病毒過程中起到重要作用，可提前判斷病毒的滴度與活力，為科學防控流感提供技術支持。

參考文獻：

[1]郭麗茹，孔梅，李曉燕，等.2010年-2013年天津市流感病原學監測分析[J].中國衛生檢驗雜志，2013，23（13）：2795-2797.

[2]董曉春，李琳，徐文體，等.流感病毒MDCK細胞分離陽性率的影響因素分析[J].中國衛生檢驗雜志，2014，24（11）：1582-1583，1587.

[3]馬萍，李欣玥.流感病毒在狗腎上皮細胞上的最優培養條件[J].現代預防醫學，2017，44（23）：4326-4331.

[4]崔志英.倒置顯微鏡技術發展趨勢[J].科技傳播，2016，8（13）：148-149.

[5]許沙沙，田鵬，曹開源.甲型流感病毒的研究進展[J].熱帶醫學雜志，2015，15（10）：1450-1452，1455.

收稿日期：2019-3-6;修回日期：2019-3-26

編輯/杜帆