RORα對人胃癌細胞株AGS凋亡的影響

俞浩遠 梁瑞 王晶晶 汪正廣

摘要：目的? 探尋維甲酸相關孤兒受體（RORα）對于人胃癌細胞AGS的凋亡的影響。方法? 根據處理濃度不同將以1 μmol/L的SR001處理的AGS設為1 μmol/L濃度組，將以0.1 μmol/L的SR001處理的AGS設為0.1 μmol/L濃度組，另設溶媒組及對照組，分別給予等量的溶媒、等量喜樹堿（50 μmol/L）處理。采用MTT檢測化療藥物5-FU介導的細胞凋亡情況，Western blot檢測細胞中磷酸化RORα（p-RORα）的表達及cleaved caspase-3的蛋白的含量并比較。結果? 用RORα激動劑處理可顯著增加5-FU介導的AGS細胞凋亡率，差異有統計學意義（P<0.05）;RORα激動劑處理48h后，人胃癌細胞中磷酸化RORα的表達增高，cleaved caspase-3的蛋白含量增多，差異有統計學意義（P<0.05）。結論? RORα可以提高人胃癌細胞AGS5-中FU介導的細胞凋亡，具有作為化療藥物的增敏劑的潛質。

關鍵詞：RORα;胃癌;化療增敏劑

中圖分類號：R735.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.16.020

文章編號：1006-1959（2019）16-0066-04

Abstract：Objective? To investigate the effect of retinoic acid-related orphan receptor （RORα） on apoptosis of human gastric cancer cell AGS. Methods? According to the treatment concentration， AGS treated with 1 μmol/L SR001 was set to a concentration of 1 μmol/L， and AGS treated with 0.1 μmol/L SR001 was set to a concentration of 0.1 μmol/L， and a solvent group and a control group were additionally provided. An equal amount of vehicle and an equal amount of camptothecin （50 μmol/L） were separately administered. MTT was used to detect 5-FU-mediated apoptosis. The expression of phosphorylated RORα （p-RORα） and cleaved caspase-3 protein were detected by Western blot.Results? Treatment with RORα agonist significantly increased the apoptosis rate of 5-FU-mediated AGS cells，the difference was statistically significant（P<0.05）. After treatment with RORα agonist for 48 h， the expression of phosphorylated RORα was increased in human gastric cancer cells，The protein content of cleaved caspase-3 increased， the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion? RORα can increase the apoptosis of human gastric cancer cell AGS5-FU， and it has the potential as a sensitizer for chemotherapy drugs.

Key words：RORα;Gastric cancer;Chemotherapy sensitizer

胃癌（gastric cancer，GC）是最常見的消化道惡性腫瘤之一，全球約25%胃癌患者在中國，其發病率在男性惡性腫瘤中僅次于肺癌占第2位，在女性惡性腫瘤中居第4位，胃癌的死亡率在我國居惡性腫瘤首位[1，2]。化療在胃癌綜合治療中發揮了重要作用，成為其治療的主要方法之一。近年來，研究發現化療增敏劑可提高化療藥物的療效，為胃癌的綜合治療帶來新的曙光，維甲酸相關孤兒受體（retinoid-related orphan receptors alpha，RORα）抑制結腸癌細胞增殖和乳腺癌細胞侵襲能力，但其是否具有抑制胃癌細胞增殖的作用報道罕見。以往研究顯示，RORα在人正常胃組織中的表達明顯高于人胃癌組織，并且隨著TMN 分期增長，RORα在人胃癌組織的表達量逐漸減少[3]，本研究旨在初步探討RORα對胃癌的影響及其可能的分子機制，用藥物SR1001處理人胃癌細胞AGS，檢測處理后細胞生物學行為改變，并檢測Caspase-3蛋白的表達來探討其潛在的分子機制，為應用于RORα作為臨床治療靶點提供理論依據。

1材料與方法

1.1主要材料? 人胃腺癌細胞AGS購自美國模式培養物存庫（American type culture collection，ATCC），RORα激動劑SR1001購于美國Cayman公司（規格：1 mg貨號：10922），胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司，F12培養基購自Hyclone公司，小鼠抗人單克隆抗體β-actin 購自美國Santa Cruz 公司，蛋白裂解液（Tris-HCl、pH 7.4，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1%Triton，0.1% SDS，5 mg/ml Leupeptin，1 mmol/L PMSF），MTT細胞凋亡試劑盒購自Beyotime公司。

1.2細胞培養? AGS培養于含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素及鏈霉素）的F12培養基中，培養條件為37℃，5%CO2、飽和濕度，每2 d更換1次培養基，并種植于6孔板中，細胞密度為1×106/2 ml。根據處理濃度不同分組，將以1 μmol/L的SR001處理的設為1 μmol/L濃度組，將以0.1 μmol/L的SR001處理的設為0.1 μmol/L濃度組;另設溶媒組及對照組，分別給予等量的溶媒、等量的喜樹堿（50 μmol/L）。

1.3 MTT試劑盒檢測RORα對胃癌細胞凋亡的影響? 取經培養好的AGS，消化后進行細胞濃度檢測，并用培養基調整至5000 個/100μl;加入96孔板中，SR1001 1 μmol/L濃度組，0.1 μmol/L濃度組及溶媒組每孔加入10 μl的5-FU（10 μg/ml），對照組每孔加入對照藥物（50 μmol/L喜樹堿），PBS封閉周圍一圈，每孔加入10 μl配制好的MTT溶液，輕輕混勻，培養箱中孵育4 h后取出，再給予每孔加入100 μl試劑盒中的Formazen溶解液，輕柔混勻繼續放置培養箱中孵育4 h，使用普通光學顯微鏡下觀察，當紫色結晶全部溶解后，采用酶標儀在570 nm測定吸光度值，以上實驗重復3次。

1.4 Western blot檢測蛋白表達? 根據不同的處理方法將AGS細胞分組，分別為SR1001 1 μmol/L濃度組，0.1 μmol/L濃度組及溶媒組。細胞處理24h后用PBS 洗3遍，用細胞刮刮下培養瓶中的細胞，并用移液槍把液體吸到標記好的1.5 ml EP管中，每瓶加入蛋白裂解液100 μl，放置于冰上裂解30 min，每10 min振蕩混勻1次，4 ℃高速冷凍離心機以14000 r/min離心30 min吸取上清液，加入蛋白上樣緩沖液，充分混勻，于沸水中煮沸10 min后置-80℃保存。根據BCA蛋白定量，每組取含有等量的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉2 h 后，用含0.05% Tween-20 的TBS 洗膜3遍，分別加入Caspase-3、β-actin抗體4℃孵育過夜，再用含0.05% Tween-20 的TBS 洗膜3遍后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h，TBS洗膜3次，ECL發光試劑盒顯影。用軟件image J測定各條帶的灰度值，以β-actin 為參照，計算相對條帶的灰度值。以上實驗重復3次。

1.5觀察指標? 觀察MTT檢測化療藥物5-FU介導的細胞凋亡情況，AGS細胞中磷酸化RORα（p-RORα）的表達及cleaved caspase-3的蛋白的含量并比較。

1.6統計學處理? 采用SPSS 18.0統計軟件進行分析，計量資料使用（x±s）表示，采用單因素方差分析（oneway-ANOVA）。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 RORα激動劑對AGS細胞中RORα磷酸化的影響? 采用Western blot檢測細胞中磷酸化RORα（p-RORα）的表達結果顯示，與溶媒組比較，SR1001可以增強AGS細胞中p-RORα蛋白的表達，見圖1A，并采用image J檢測相關條帶的灰度值的相對百分比，其差異有統計學意義（P<0.05），見圖1B。

2.2 RORα激動劑對5-Fu介導的細胞凋亡率的影響? RORα激動劑處理顯著增加5-FU介導的AGS細胞凋亡，差異有統計學意義（P<0.05），見圖2。

2.3 RORα對細胞中凋亡蛋白的影響? ?RORα激動劑處理后cleaved caspase-3水平增加，見圖3A。 ImageJ軟件測量圖3A中 cleaved caspase-3條帶的灰度值并計算其相對于溶媒組的百分比，其差異有統計學意義（P<0.05），見圖3B。

3討論

RORs是核受體的一個家族，是細胞內轉錄因子的一員。RORs 包括RORα（NR1F1）， RORβ（NR1F2）及RORγ（NR1F3）三個成員，RORα最早于上世紀九十年代被發現，因結構與維甲酸受體及維甲類X受體相似而得名[4]，之后RORβ和RORγ被依次發現。RORα、RORβ及 RORγ在不同種屬及不同組織中表達不同，RORα廣泛分布于肝臟、骨骼肌、皮膚、脂肪組織、腎臟、胸腺及腦組織中，RORα有α1、α2、α3、α4四種亞型，在鼠類中僅存在α1和α4兩種亞型[5，6];RORβ有β1，β2兩種亞型，只有β1亞型存在人類中，RORβ的表達與神經系統相關，分布于腦及視網膜。RORγ有γ1，γ2兩種亞型，分布于免疫系統，RORγ2高度表達于胸腺組織，故也常被稱為RORγt。RORs能識別特定的DNA序列（通常由TAAA/ TNTAGGTCA組成），即ROR反應元件（RORE），作為單體與之結合，而不像大多數受體以二聚體形式結合，這也是其被稱為孤兒受體的原因。

RORα廣泛分布于組織中，被稱為生物節律，脂質代謝和免疫炎癥反應的調節劑。研究表明RORα可能在癌癥發展中起作用，腫瘤微環境在結直腸癌中至關重要。RORα抑制結腸直腸癌細胞增殖，遷移和誘導血管生成，是通過影響脂肪細胞的方式來介導[7]，有研究表明，與癌旁組織相比，在肝癌細胞中存在RORα低表達的情況，并且這種表達與腫瘤的臨床病理特征有相關性，低RORα表達的肝癌患者具有較高的AFP水平，較差的病理學分級，腫瘤復發和血管侵入的傾向。然而，在RORα表達與年齡，性別，乙型肝炎血清抗原（HBsAg）狀態，腫瘤大小或肝硬化之間未觀察到統計學上顯著的相關性。此外，RORα與腫瘤患者預后有關，低RORα表達的患者具有比高表達的患者總體生存率更低，無病生存時間更短[8]。

有研究顯示RORα參與前列腺素介導的Wnt信號傳導，并且似乎更像是是中心分子開關[9，10]。在肝細胞肝癌中，約65%的患者存在RORα低表達，且其總體生存率和無病生存時間更短[8]，另外RORα高表達可抑制胃癌細胞MGC803細胞增殖與遷移侵襲，將細胞阻滯于G2/M期，其機制可能與下調MMP-9和上調TIMP3有關[11]。本研究中采用RORα激動劑SR1001來提高RORα的磷酸化，并采用MTT試劑盒檢測其對細胞凋亡的影響發現，相對于溶媒組，提高RORα的磷酸化后，5-FU介導的細胞凋亡率增加，并且相關凋亡蛋白含量增高，表明RORα可以增加5-FU介導的胃癌細胞的凋亡。

綜上所述，RORα可以增加5-FU介導的胃癌細胞的凋亡，具有作為5-FU化療藥物的增敏劑的潛質，為研發新型的化療藥物或增敏劑提供新的思路。

參考文獻：

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收稿日期：2019-5-25;修回日期：2019-7-3

編輯/肖婷婷