轉基因水稻蛋白試紙條與P C R定性檢測技術比較研究①

劉倩琪

(廣東省深圳市農業科技促進中心 廣東深圳 518054)

轉基因作物檢測是農業安全監管的基礎，目前國內外檢測轉基因生物及其產品最常用的方法有PCR核酸定性、定量法，該方法需要專業技術人員采用專用儀器設備進行檢測，檢測周期較長、檢測成本較高。試紙條法是一種簡便、快速的檢測方法，專業技術人員經過簡單培訓即可進行現場檢測。但鑒于目前轉基因作物種類和品系日漸增多，篩選基因、外源基因、外源蛋白等日趨增加，蛋白檢測試紙條的品牌、型號等也越來越多，因此，明確2種方法的準確性、特異性、靈敏度，比較2種檢測方法的優劣，確定各自的適用范圍具有重要意義。

1 研究內容

采用不同品牌試紙條檢測商業化轉基因水稻，比較各品牌試紙條的準確性、特異性、靈敏度。

采用PCR定性檢測法檢測轉基因水稻、標記基因及品系特異性序列，確定PCR法的局限性、準確性、靈敏度。

分析蛋白檢測試紙條法與PCR定性檢測法檢測結果的相關性；比較不同試紙條的優缺點，及其各自的適用范圍。

2 研究材料

轉基因水稻汕優63(TT51-1)品系4個濃度(5%、1%、0.5%、0%)樣品，由上海交通大學提供。

轉基因水稻科豐6號(KF6)、Ⅱ優科豐6號(Ⅱ優KF6)、克螟稻(KMD)、M12品系1%粉末，由農業農村部科技發展中心提供。

3 研究方法

按照轉基因水稻品系、檢測參數、外源蛋白等不同分別設計試驗方案，并確定每個品系采用的核酸檢測方法和試紙條類型。

3.1 PCR定性檢測法

采用農業農村部頒布的轉基因植物及其產品成分檢測相關檢測標準，對轉基因水稻不同品系各個參數進行檢測。

3.2 蛋白試紙條檢測法

本次試驗購買了8個品牌試的轉基因蛋白檢測的試紙條，其中，國內品牌5個，分別是上海佑隆、中科院油料所、武漢上成、浙江拓普、廣州金標；進口品牌3個，分別是Agdia(美國)、Envirologix(美國)、Artron(加拿大)。檢測的蛋白涵蓋了常見的抗蟲、抗除草劑蛋白[1]。

4 結果與分析

4.1 PCR定性檢測法檢測不同轉基因水稻的準確性、特異性、靈敏度

采用KF6(1%)、Ⅱ優KF6號(1%)、KMD(1%)、M12(1%)、TT51-1(濃 度 5%、1%、0.5%、0%)5個品系的陽性標準品，依據農業農村部頒布的一系列轉基因成分檢測標準為依據，采用PCR定性檢測法檢測了4個篩選基因(CaMV35S、NOS、NPTⅡ、HPT)、1個 Bt目 的 基 因、3個 品 系(KMD、M12、TT51-1)特異性序列。結果(表1)顯示，各轉基因陽性標準品可以通過4個篩選基因(CaMV35S、NOS、NPTⅡ、HPT)及 1個 Bt目 的基因進行初步篩選檢測，每個品系檢測結果與此前所搜集到的各項轉基因水稻品系核酸檢測參數信息一致，根據篩選基因的檢測結果進行特異性更高的品系特異性檢測，3個品系(KMD、M12、TT51-1)特異性序列的檢測結果均為陽性。KF6、Ⅱ優KF6號因缺乏相應的檢測標準，而未能檢測。

此次試驗同時還檢測了TT51-1的 4個濃度梯 度 (5%、1%、0.5%、0%)， 其 中 NOS、Bt、TT51-1均能檢測到0.5%濃度。

4.2 不同試紙條檢測商業化轉基因水稻的準確性、特異性、靈敏度

采用 KF6(1%)、Ⅱ優 KF6(1%)、KMD(1%)、M12(1%)、TT51-1(濃度5%、1%、0.5%、0%)5個品系的陽性標準品，用8個品牌的Cry1Ab/Cry1Ac試紙條進行檢測。結果(表2)顯示，8個品牌的試紙條均能檢測出5%濃度的TT51-1。除了廣州金標試紙條僅能檢測出5%濃度TT51-1，其余所有樣品的檢測結果均為陰性。武漢上成、浙江拓普、上海佑隆和Envirologix 4個品牌的試紙條檢測1%KF6、1%Ⅱ優KF6、1% KMD、TT51-1(5%、1%、0.5%)結果均為陽性。油料所、Agdia、Artron 3個品牌的試紙條均能檢測出1% KF6、1% Ⅱ優KF6、1%KMD、1% M12、5% TT51-1，但無法檢測出0.5%TT51-1。各品牌試紙條檢測M12結果均為陰性，即M12含有抗除草劑EPSPE蛋白，但不含有抗蟲Cry1Ab/Cry1Ac蛋白。同時，8個品牌的試紙條均無法鑒定轉基因水稻品系[2]。

表1 水稻PCR檢測結果

表2 不同品牌試紙條檢測轉基因水稻結果比較

5 結論

5.1 PCR核酸定性檢測法與試紙條檢測法的局限性比較

目前，檢測水稻中轉基因成分的商業化試紙條只有Bt-Cry1Ab/1Ac免疫診斷試紙條，其他抗病毒、品質改良的轉基因水稻品系都無法檢測。已知的9個轉基因水稻品系中只有4個品系含有Cry1類抗蟲蛋白，也就是說，現有的試紙條只能檢測轉Cry1類抗蟲蛋白的品系[3]。PCR定性檢測法可以檢測水稻中CaMV35S、NOS、Bt、hpt、SCK等參數，在已知的9個轉基因水稻品系中至少含有CaMV35S、NOS、Bt、hpt中的一個參數，漏檢概率遠遠小于試紙條檢測法。

5.2 PCR核酸定性檢測法與試紙條檢測法的準確性比較

由于現有商業化試紙條只能檢測Cry1類抗蟲蛋白，具體是Cry1Ab、Cry1Ac，還是Cry1Ab/1Ac，需要多張試紙條才能檢測，且無法判斷品系。此外，試紙條檢測需要提取樣品中的粗蛋白，現場檢測存在粉碎樣品、沉淀或離心、清洗等條件的局限，一般存在取樣量較少、樣品代表性不夠等問題，而國產試紙條的靈敏度只有1%，因此存在漏檢(即假陰性)的風險。PCR定性檢測法可直接檢測轉基因水稻中的外源基因片段，對于有爭議的陽性結果還可以采用酶切、測序等方法輔助判斷，因此，準確性遠遠高于試紙條檢測法。

5.3 PCR核酸定性檢測法與試紙條檢測法的靈敏性比較

目前僅GB/T 19495.8—2004規定了轉基因植物蛋白檢測方法，主要針對抗蟲基因Cry1Ab/1Ac試紙條法。該標準規定試紙條法主要檢測轉基因棉花中的Cry1Ab/1Ac蛋白，同時也適用于其他含有Cry1Ab/1Ac蛋白的轉基因植物，但檢測靈敏度必須保證在0.25%以上。而現有國產轉基因Cry1Ab/1Ac快速測試紙條的靈敏度為1%，進口試紙條檢測靈敏度大于0.1%。根據資料以及本單位做過的若干次核酸定性試驗的數據顯示，一般PCR定性檢測的靈敏度能達到0.1%；若以基體陽性樣品為材料，最高的靈敏度能達到0.05%；若以DNA陽性樣品為材料，最高的靈敏度能達到0.01%。