利用植物揮發物提升冬季設施草莓蜜蜂授粉效率

張軍飛，邱一蕾，柴秋子，余紅，李紅亮*

(1.中國計量大學 生命科學學院，浙江 杭州 310018；2.杭州市農業科學研究院，浙江 杭州 310024)

草莓(FragariaananassaDuch.)是一種薔薇科植物，果實鮮美，深受廣大群眾喜愛[1]。草莓難以在野外過冬，因而目前冬季草莓以大棚栽培為主，即設施草莓。大棚內環境相對密閉，濕度大、空氣流動性差，且缺少自然授粉媒介活動，并不利于草莓授粉受精，因此，需要采用人工授粉或者蜜蜂授粉的方法來提高授粉效率[2]。由于人工授粉費時費力，且效果不理想[3]，因此，目前設施大棚常采用中華蜜蜂授粉的方法來提高草莓的授粉率[4]。

中華蜜蜂(ApisceranaceranaFabricius，簡稱中蜂)是中國人工飼養規模最大的蜂種，善于采集零星蜜源，消耗飼料少，易于管理，耐低溫(10 ℃左右仍能正常采集飛行)[5]，是冬季及早春溫度較低狀態下設施草莓授粉效果最佳的蜂種之一[6]。為了進一步提高蜜蜂的授粉效果，現有的可實施技術措施主要從作物栽培與蜂群管理出發——授粉作物需分布合理并處于良好的生長狀態，根據作物情況合理配置與管理授粉蜂群，為蜂群提供作物蜜源的誘導信息，吸引蜜蜂采訪[7]。然而，在實際栽培中很難滿足上述所有條件，因而蜜蜂的授粉效果雖比人工授粉好，但仍未達到最優狀態，也就是說，在蜜蜂的授粉效果上仍有很大的發揮空間。

在以活框飼養方式為主的傳統養蜂業中，為了獲取最大經濟利潤，蜂農往往會在入冬前將蜂群巢蜜割凈，采用飼喂糖水的方式來維持蜜蜂的基本生存[8]。當這些中蜂被莓農用于其設施草莓授粉時，用傳統非活框的圓木桶方式飼養，但飼喂方式基本不變。這種噴施糖水的方式給蜜蜂提供了足夠的蜜源，使蜜蜂變得懶惰，長此以往反而會使蜜蜂不愿出去采蜜，從而導致其授粉效率下降。為了有效地提高冬季設施草莓授粉蜜蜂的活力和授粉效率，停用糖水飼喂方式，通過試驗篩選出花香揮發物嗅覺活性劑，形成復合糖水增效劑，通過噴施復合糖水增效劑，誘導并促進蜜蜂工蜂出巢授粉，提高了中蜂嗅覺敏感性和其出巢、訪花的頻率，延長了單花停留時間，從而提升了授粉效率，為草莓增產增效提供了新途徑。現總結報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

在中華蜜蜂嗅覺活性劑的篩選試驗中，中華蜜蜂為本實驗室內人工飼養的種群。在噴施復合糖水增效劑試驗中，所用中蜂群購自杭州建德山區，采用常規的土法圓木桶法養殖。試驗所用草莓品種為豐香，由杭州市農業科學研究院農業生物技術研究所提供。試驗于杭州市農業科學研究院農業生物技術研究所草莓溫室大棚基地進行。

觸角電位儀由荷蘭Syntech公司生產。β-紫羅蘭酮，3,4-二甲基苯甲醛，苯甲醛，對羥基苯甲酸甲酯(HOB)，E,E-法尼醇，液狀石蠟等化學試劑均購自百靈威公司(純度>97%)。飼喂蜜蜂的糖水(質量分數25%)，用適量白砂糖溶解于滅菌水中配置而成，煮沸15 min，冷卻后使用。

1.2 中華蜜蜂嗅覺活性劑成分的篩選

試劑及刺激樣品的制備。選擇活性較強的4種植物揮發物(β-紫羅蘭酮、甲基丁香酚、3,4-二甲基苯甲醛、苯甲醛)和2種蜜蜂信息素(對羥基苯甲酸甲酯、E,E-法尼醇)進行試驗。分別將供試的各化合物溶于液狀石蠟，并配成10%溶液，在EAG昆蟲觸角電位測量系統上進行測定。劑量反應測試時，選擇熒光結合試驗中具有代表性的化合物，用溶劑作為對照。

觸角電位測定。首先用手術刀將中華蜜蜂觸角從基部切下，然后小心地將中華蜜蜂觸角的兩端用導電膠分別黏在EAG昆蟲觸角電位測量系統的金屬電極上。觀察顯示屏上的基線變化情況，待基線平穩，表明觸角已經穩定，且反應良好，可以開始試驗。

在濾紙條上(2 cm×0.5 cm)滴加10 μL待測樣品溶液，使溶劑揮發一會兒后，再將濾紙塞進巴斯德管內，用錫箔紙把管口兩端封住，防止樣品揮發。另取10 μL液狀石蠟+濾紙作為空白對照。測試時，將巴斯德管一端插入送氣管外側直徑2 mm的小孔內，送氣管管口與觸角縱向垂直，并與觸角相距1 cm左右。同時點擊手標和踩腳踏板，刺激時間0.2 s，刺激氣流100 mL·min-1，2次刺激相隔2 min，以保證觸角感覺器的感覺功能完全恢復。隨機測定待測樣品，由于隨著時間延長，觸角的生理活性也會跟著降低，為了避免此種情況對試驗造成不利影響，以體積分數1%的葉醇-石蠟溶液作為標準參照刺激，對各測試樣品的刺激反應進行標準化校正。預試驗發現，中華蜜蜂對葉醇的反應存在穩定的峰值，所以選擇葉醇作為標準參照。在測定樣品前，先進行1次對照(液狀石蠟)和標準參照刺激，然后測試5個樣品，再進行對照和標準參照刺激，如此循環往復，每個觸角約測試5個樣品，每個待測樣品重復6次。EAG反應值的計算公式如下：

式中：S為中華蜜蜂對某化合物EAG反應的相對值，Sc為中華蜜蜂對某化合物的EAG反應值，Cm為測定此化合物前后的對照2次EAG反應的平均值，Rm為測定此種化合物前的標準參照EAG反應的平均值。

1.3 復合糖水增效劑噴施對草莓授粉的效果測定

利用中蜂的自然授粉規律和嗅覺機理，通過1.2節試驗篩選和設計了中蜂嗅覺活性劑成分。試驗時，將溫室大棚3等分，依次作為對照區、緩沖區和處理區。中蜂蜂桶處于緩沖區的中間點，蜂桶墊高50 cm左右，巢門朝南，待蜜蜂計數器安裝、調試完畢后，進行試驗，并記錄相關數據。試驗期間溫室均不施用任何除草劑和殺蟲劑，整個過程不飼喂糖水。將經篩選的中蜂嗅覺活性劑有效成分與25%的糖水混合，形成復合糖水增效劑，噴施于處理區，以25%糖水作為對照，同時記錄同一時間段內蜜蜂的活動情況。

1.4 測量指標的定義和數據統計方法

在草莓盛花期進行試驗時，將草莓大棚分為一個個規格2 m×2 m的樣方。當中蜂進入樣方訪問第1朵花時開始用秒表計時，離開樣方時停止計時，記錄此間該中蜂訪問的草莓花朵總數。將每只中蜂工蜂1 min內訪問的草莓花總數定義為蜜蜂的訪花頻率；蜜蜂從接觸一朵花到離開這朵花所經過時間定義為單花停留時間。

利用SPSS 16.0軟件對獲得的試驗數據進行處理和分析。對EAG反應的相對值，做單因素方差分析，并用Duncan法進行多重比較。針對不同處理的蜜蜂訪花頻率、單花停留時間，用t-test進行檢驗。試驗數據用Origin v8.5做圖。

2 結果與分析

2.1 中華蜜蜂嗅覺活性劑成分篩選

研究中華蜜蜂對4種植物揮發物和2種蜜蜂信息素的EAG反應，結果如表1所示。中華蜜蜂工蜂對兩種花香類物質(β-紫羅蘭酮、甲基丁香酚)的反應值最大，其次是2種蜜蜂信息素(對羥基苯甲酸甲酯、E,E-法尼醇)，中華蜜蜂工蜂對β-紫羅蘭酮、甲基丁香酚的嗅覺反應顯著強于蜜蜂信息素，且中華蜜蜂工蜂對β-紫羅蘭酮、甲基丁香酚的EAG反應值差異不顯著。結果表明，β-紫羅蘭酮、甲基丁香酚這2種花香類物質更能夠引起蜜蜂的嗅覺反應，可以初步確定為嗅覺活性劑的有效成分。

表1 中華蜜蜂對植物揮發物和蜜蜂信息素的觸角電位反應

注：同列數據后無相同字母的表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 復合糖水增效劑噴灑草莓對中蜂訪花頻率和單花停留時間的影響

選擇β-紫羅蘭酮代表植物揮發物，HOB代表信息素，分別構建糖水+嗅覺活性劑的組合。由圖1可以看出，噴施糖水和添加HOB的復合糖水增效劑后，中華蜜蜂的訪花頻率并沒有顯著變化，但當噴施添加β-紫羅蘭酮的復合糖水增效劑后，中華蜜蜂的訪花頻率較噴施糖水的處理顯著增加。

噴施糖水后，相較于對照(空白)，中華蜜蜂的單花停留時間極顯著延長；噴施添加β-紫羅蘭酮的復合糖水增效劑后，相較于噴施糖水的處理，中華蜜蜂的單花停留時間極顯著縮短；噴施添加HOB的復合糖水增效劑后，相較于噴施糖水的處理，中華蜜蜂的單花停留時間無顯著變化。

綜合上述結果，噴施糖水+β-紫羅蘭酮的復合糖水增效劑能使蜜蜂的訪花頻率提高20.7%，有效提高蜜蜂的授粉活性，但以糖水+HOB配制的復合糖水增效劑對中華蜜蜂授粉活性并無顯著影響。

圖中標*或**的分別表示差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)。圖1 不同處理對中華蜜蜂訪花頻率和單花停留時間的影響

3 討論

昆蟲利用嗅覺搜尋食物和配偶。對于蜜蜂而言，工蜂的出巢飛行軌跡與植物蜜源地密切相關。本研究中，中蜂對β-紫羅蘭酮和甲基丁香酚，以及兩種蜜蜂信息素(對羥基苯甲酸甲酯、E，E-法尼醇)的EAG反應值較大。β-紫羅蘭酮是一種常見的植物花香類分子[9]。在前期研究中，發現其與中華蜜蜂的化學感受蛋白和氣味結合蛋白都能夠產生較強的結合[10]。而且，嗅覺蛋白與這些植物揮發物成分結合時，其結合常數隨溫度的升高而增加[11]。作為蜂王信息素的一種成分，對羥基苯甲酸甲酯與中蜂的一種信息素結合蛋白也能夠產生較強的結合[12]，但與植物性氣味不同的是，這種信息素與信息素結合蛋白的結合隨溫度的上升而下降，呈現靜態猝滅特征[13]。本研究也發現，糖水和植物揮發素組合配置的復合糖水增效劑能有效提升蜜蜂在特殊環境下的活性，而糖水和信息素組合配置的復合糖水增效劑卻無此效果。

利用糖水、糖水+β-紫羅蘭酮、糖水+HOB處理草莓樣方，記錄中蜂的訪花頻率和單花停留時間，結果顯示，糖水+β-紫羅蘭酮的處理較糖水而言，能顯著提高蜜蜂的訪花頻率，從而提高授粉活性，這為破解冬季低溫弱光條件下蜜蜂活性低的問題提供了新的思路。

本試驗中嗅覺活性劑均以糖水作為溶劑，是考慮到糖水具有蜜蜂敏感的食物氣味，以其作為基礎性的氣味源有助于體現嗅覺活性劑的本底活性。本試驗也證明，單獨的糖水僅能延長蜜蜂的單花停留時間，對蜜蜂的訪花頻率并沒有顯著影響，必須加入相應的嗅覺活性劑，如β-紫羅蘭酮才能夠提高訪花頻率，從而提高蜜蜂的授粉活性。