金匱腎氣湯對糖尿病腎病小鼠足細胞凋亡信號的影響

劉春燕，楊勝輝，朱 偉，曾 輝，魏 科，唐 群

(湖南中醫藥大學1. 病理學教研室、2. 預防醫學教研室、3. 生理學教研室、4. 病原生物學教研室，湖南長沙 410208)

研究表明，糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)占終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的30%～47%，是糖尿病患者死亡的主要原因[1]。足細胞(podocyte)損傷是導致蛋白尿持續發生和DN進展的重要原因。足細胞損傷與凋亡增加密切相關，高糖狀態下，足細胞內活性氧(reactive oxygen specie，ROS)的生成增多[2]，可能通過JNK1信號通路，導致Bcl-2磷酸化，從而促進足細胞凋亡，裂孔隔膜蛋白Podocin丟失，導致蛋白尿的產生[3-4]。

金匱腎氣湯是溫補腎陽、化氣行水的代表方。研究發現，金匱腎氣湯能通過調節Bcl-2/Fas基因表達，從而抑制腎小球細胞凋亡[5]。本研究旨在通過db/db糖尿病小鼠模型，觀察金匱腎氣湯對足細胞凋亡和JNK1/Bcl-2信號通路的影響，探討金匱腎氣湯改善DN進展的分子機制，為臨床防治DN提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立4周齡♂SPF級C57BL/KsJ-db/db小鼠15只，作為Ⅱ型糖尿病動物模型；4周齡♂C57BL/KsJ-db/m小鼠5只，作為對照組(control)。小鼠購自上海市斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(滬)2012-0002，實驗單位使用許可證號：SYXK(湘)2014-0012。6周齡時，將15只db/db小鼠隨機分為3組，并灌胃，分別為：生理鹽水組(db/db,n=5)，金匱腎氣湯組(db/db+JG，n=5)，二甲雙胍陽性對照組(db/db+MF,n=5)。于18周齡時處死小鼠。

1.2 藥物制備金匱腎氣湯各配方顆粒購自江陰天江藥業有限公司，成人每日量10 g，包括熟地黃4 g(相當于飲片量為10 g，下括號內數值同)，茯苓顆粒1 g(10 g)，牡丹皮顆粒1 g(6 g)，澤瀉1 g(10 g)，山藥0.5 g(10 g)，酒萸肉1.5 g(6 g)，桂枝0.5 g(6 g)，附片0.5 g(3 g)。將每10 g顆粒充分溶解于加熱后的蒸餾水中。藥物根據動物/人體表面積法折算，結合前期實驗結果，金匱腎氣湯組為2.6 g·kg-1。鹽酸二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司)，溶解于蒸餾水中，劑量為0.2 g·kg-1。

1.3 血糖、尿白蛋白檢測小鼠18周齡時，留24 h尿液，用白蛋白測定試劑盒(寧波醫杰生物科技有限公司)測定24 h尿白蛋白排泄量；尾靜脈取血，用血糖儀(三諾GA-3血糖試條，三諾生物傳感股份有限公司)檢測隨機血糖。

1.4 腎組織病理學檢查處死小鼠后，留取雙側腎組織，一部分腎組織用4%多聚甲醛固定后，制備厚3 μm石蠟切片，進行過碘酸希夫反應(PAS)染色，用奧林巴斯BX-50顯微鏡觀察腎小球內系膜區細胞外基質增生情況。另一部分腎組織用2.5%戊二醛固定后，制作成50～100 nm切片，用3%醋酸鈾以及硝酸鉛雙染色，透射電子顯微鏡(日立H7700)觀察腎小球足細胞超微結構。

1.5 免疫熒光采用間接免疫熒光染色法，按照試劑盒的操作步驟，檢測足細胞標志蛋白Podocin(抗體購自Abcam公司，貨號：ab50339)在腎小球內的表達。在共聚焦熒光顯微鏡(日本奧林巴斯)下對組織進行檢測，腎小球內亮綠色為陽性結果。

1.6 Western blot檢測一部分腎皮質(沿縱切面剖開腎臟后，沿皮髓分界線去除髓質)采用2×SDS裂解液提取總蛋白，BCA法進行蛋白定量，SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，轉PVDF膜。脫脂奶粉室溫封閉1 h后，分別加入p-Bcl-2(美國Santa Cruz公司)、JNK1(美國CST公司)、p-JNK1(美國CST公司)、caspase-3(美國CST公司)的一抗(1∶500或1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗3次，加入二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST洗3次，用ECL(美國ThermoFisher公司)顯色并曝光，采用ImageJ軟件進行條帶灰度掃描。

2 結果

2.1 金匱腎氣湯對血糖和尿蛋白的影響為探討金匱腎氣湯對db/db小鼠的腎保護作用，本實驗測定了血糖和尿白蛋白水平。Tab 1結果顯示，db/db小鼠血糖和24 h尿白蛋白水平明顯高于正常大鼠(P<0.01)，提示db/db糖尿病小鼠腎功能受損。治療后，二甲雙胍可使db/db小鼠血糖和24 h尿白蛋白水平明顯降低(P<0.05)；金匱腎氣湯組可明顯降低db/db小鼠24 h尿白蛋白(P<0.05)，但對血糖影響不明顯，提示金匱腎氣湯可減輕db/db小鼠腎臟損傷。

Tab 1 Comparison of random blood glucose and urinary albumin/creatinine in different groups of mice

2.2 金匱腎氣湯改善db/db小鼠腎小球病變采用PAS染色觀察db/db小鼠腎小球的病理變化。根據2017年腎活檢病理診斷報告模式專家共識[6]，腎小球系膜區增寬程度分為輕度(系膜區寬度<毛細血管襻直徑)、中度(系膜區寬度>毛細血管襻直徑)及重度(系膜基質擠壓襻呈結節、團塊或分葉狀)。如Fig 1所示，與對照組相比，db/db小鼠生理鹽水組腎小球系膜區明顯增寬，呈中度增生；金匱腎氣湯組及二甲雙胍組小鼠腎小球內系膜區增寬程度較生理鹽水組明顯減輕，呈輕度增生。表明金匱腎氣湯緩解了db/db小鼠腎小球系膜病變。

Fig 1 Pathological changes of kidney in each group of mice(PAS, ×400)

2.3 金匱腎氣湯對db/db小鼠腎小球足細胞損傷的影響為了觀察金匱腎氣湯對足細胞損傷的保護作用，采用透射電子顯微鏡觀察足細胞超微結構。如Fig 2所示，正常對照組小鼠腎小球足細胞足突清晰、呈指狀覆蓋在腎小球基底膜外；db/db糖尿病小鼠腎小球內足細胞足突倒伏、足突相互融合、部分足突消失；金匱腎氣湯和二甲雙胍治療后，足突倒伏、足突融合情況明顯好轉，大部分足突呈指狀覆蓋在腎小球基底膜外。此外，我們采用免疫熒光標記腎小球內足細胞標志蛋白Podocin的表達。如Fig 3所示，Podocin在正常對照組小鼠腎小球內沿毛細血管襻呈均勻連續的線樣分布；db/db糖尿病小鼠生理鹽水組腎小球內線樣分布的Podocin免疫熒光消失、呈微弱顆粒狀熒光；金匱腎氣湯和二甲雙胍治療后，腎小球內出現線樣分布的Podocin免疫熒光。以上結果提示，金匱腎氣湯可減輕db/db小鼠腎臟足細胞損傷。

2.4 金匱腎氣湯對db/db小鼠腎小球足細胞凋亡的影響Western blot檢測腎組織中活化的caspase-3蛋白表達，如Fig 4所示，生理鹽水組db/db小鼠腎皮質中活化的caspase-3表達比對照組明顯升高(P<0.01)；金匱腎氣湯組和二甲雙胍組小鼠腎皮質中caspase-3表達明顯降低(P<0.05)。提示金匱腎氣湯的腎臟保護作用可能與改善糖尿病小鼠腎臟足細胞凋亡有關。

Fig 2 Transmission electron microscopy of kidneys in different groups(×2 000)

Fig 3 Immunofluorescence of podocin in kidneys of each group(×400)

2.5 金匱腎氣湯通過JNK1/Bcl-2通路調節db/db小鼠腎小球足細胞凋亡JNK1磷酸化后可使抗凋亡蛋白Bcl-2磷酸化，從而促進細胞凋亡。如Fig5所示，生理鹽水組小鼠腎皮質中p-JNK1/JNK1表達比對照組明顯升高，p-Bcl-2蛋白表達明顯增加(P<0.01)；金匱腎氣湯干預后，p-JNK1/JNK1表達下調，p-Bcl-2蛋白表達也明顯下調(P<0.05)。提示金匱腎氣湯改善糖尿病小鼠腎臟足細胞凋亡的作用可能與調節JNK1/Bcl-2通路有關。

Fig 4 Expression of caspase-3 protein in kidney cortex of each group

Fig 5 Expression of p-JNK1/JNK1 and p-Bcl-2 protein in kidney cortex of each group

3 討論

DN進展到腎功能衰竭的過程屬陽氣衰敗、水濕瘀濁內聚，因此，當以溫補腎陽、化氣行水大法。金匱腎氣湯是溫補腎陽、化氣行水的代表方。方中重用地黃滋補腎陰，臣以山藥、山茱萸補肝脾，加肉桂、附子溫陽化氣，佐以澤瀉、茯苓、丹皮利水滲濕泄肝火，廣泛應用于泌尿生殖系統等疾病的治療。

足細胞又稱為腎小囊臟層上皮細胞，附著于腎小球基底膜外側，與內皮細胞、腎小球基底膜共同構成腎小球濾過屏障，其中，足細胞間的裂孔隔膜是阻止大分子物質通過的分子屏障。Wang等[7]研究發現，DN的足細胞損傷主要是由于高糖抑制足細胞自噬水平，促進細胞凋亡，表現為標志蛋白Podocin、Nephrin表達明顯降低，最終導致蛋白尿的產生。此外，有研究表明，高糖也可誘導腎小球系膜細胞凋亡，caspase-3表達增加、Bcl-2表達下調[8]。本研究首先探討金匱腎氣湯對db/db小鼠腎臟足細胞的保護作用。結果顯示，金匱腎氣湯治療db/db糖尿病小鼠12周后，24h尿白蛋白水平明顯降低，但對血糖影響不明顯，可能與動物模型相關，也提示金匱腎氣湯對db/db小鼠的腎保護作用可能與血糖控制無關。PAS染色顯示，金匱腎氣湯治療后，系膜基質增生程度減輕。免疫熒光提示，腎小球內Podocin呈線樣分布、熒光強度增強。電鏡檢測結果顯示，用金匱腎氣湯治療后，足細胞足突倒伏、足突融合明顯好轉，大部分足突呈指狀分布在腎小球基底膜外。提示金匱腎氣湯可改善db/db糖尿病小鼠腎臟足細胞損傷，從而延緩DN進展。

Bcl-2是一種眾所周知的促存活基因，在包括足細胞在內的多種細胞系統中起重要作用[9]。Bcl-2主要通過與caspase等蛋白質的反饋系統，以及通過控制線粒體膜通透性，來調節細胞死亡[10-11]。其中，JNK1介導的Bcl-2磷酸化是調控細胞自噬和凋亡的基本通路。Bcl-2少量磷酸化可使Bcl-2/Beclin-1復合物分離，從而促進自噬，保護細胞存活；但當Bcl-2多位點磷酸化后，Bcl-2/Bax復合物被破壞，抗凋亡功能失活，caspase-3活化，caspase-3活化后被剪切成12ku和17ku的片段而發揮作用，導致凋亡發生[12-13]。在本實驗中，我們觀察到db/db小鼠腎皮質中JNK1磷酸化水平明顯增高，Bcl-2磷酸化明顯增加，活化后的caspase-3比正常對照組小鼠明顯增高，提示凋亡增多；金匱腎氣湯治療后，db/db小鼠腎皮質中JNK1和Bcl-2磷酸化水平下調，活化的caspase-3片段明顯減少，且金匱腎氣湯組比二甲雙胍組下調更明顯。結果提示，金匱腎氣湯可能通過JNK1/Bcl-2通路改善足細胞凋亡，從而保護足細胞。

綜上所述，對JNK1/Bcl-2信號途徑的調節可能是金匱腎氣湯減少足細胞凋亡，從而延緩DN進展的機制之一。

(致謝：本研究在湖南中醫藥大學醫學院實驗室、湖南斯萊克景達實驗動物有限公司、湘雅醫院病理科完成，唐笑鳳老師參與部分實驗，在此致以衷心的感謝！)