力達霉素對人宮頸癌Hela細胞周期、凋亡、自噬和上皮細胞間質轉化能力的影響

徐 珊，周 游，劉鈺妮，王世恩，楊建林，王艷林，曹春雨

(1. 三峽大學醫學院，腫瘤微環境與免疫治療湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443002；2. 宜昌市疾病預防控制中心，健康管理服務中心，湖北 宜昌 443000)

力達霉素(lidamycin，LDM)是一種大分子烯二炔類抗腫瘤抗生素，它由我國科學家首先發現于湖北省潛江縣土壤中分離出的一株鏈霉菌(StreptomycesglobisporusC-1027)中。LDM對大多數革蘭陽性菌有抑菌作用，但對革蘭陰性菌和分枝桿菌無效。進一步研究發現，LDM對多種腫瘤細胞具有強大的殺傷作用，在腫瘤臨床治療中具有重要的應用前景[1]。目前，已經證實其在體內外對多種腫瘤細胞具有殺傷力，并且其殺傷力遠高于常用化療藥[2]，但其對宮頸癌細胞作用的機制研究報道不多。本研究以宮頸癌Hela細胞為研究對象，分析LDM對宮頸癌細胞的影響及其作用的分子機制，為將LDM用于宮頸癌的臨床治療提供實驗依據。

1 材料

1.1 細胞株人宮頸癌Hela細胞株，購自武漢細胞典藏中心，由本實驗室傳代保存。

1.2 試劑LDM，由北京協和醫科大學甄永蘇教授惠贈；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，購自美國Sigma公司；DMEM培養基，購自美國Gibco公司；胎牛血清、青霉素/鏈霉素雙抗，購自天津灝洋生物；BSA蛋白定量試劑盒、凋亡試劑盒(Annexin Ⅴ-FITC、PI Staining Solution)，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；ECL超敏顯影液，購自美國Thermo Scientific公司；逆轉錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒、RNase，購自日本TaKaRa寶生物公司；結晶紫、RIPA組織/細胞裂解液，購自北京索萊寶(Solarbio)科技有限公司；Dioc6購自美國Thermo Fisher公司；Cyclin B1、Cyclin D1、p21、Bax、Bcl-2、Beclin-1抗體，均購自Proteintech公司；PARP、p62、LC3A/B、E-cadherin、MMP-9抗體，均購自Cell Signaling Technology公司；N-cadherin抗體，購自BD Transduction Lab公司；Vimentin抗體，購自Santa Cruz公司；MMP-2、LSD1抗體，均購自Abcam公司；β-actin抗體，購自北京科美博瑞公司。

1.3 儀器TE2000-S熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；全波長酶標儀(美國Thermo公司)；凝膠電泳儀、電轉儀(Bio-Rad公司)；化學發光成像系統(BIOSHine公司)；BDFACSVerse流式細胞儀(美國BD公司)；NanoDrop 2000核酸分析儀(美國Thermo Fisher公司)；ABI StepOne Plus實時熒光定量PCR儀(美國應用生物系統公司)。

2 方法

2.1 MTT法分析細胞增殖收集對數生長期細胞，調整細胞濃度至3.5×107·L-1。將細胞懸液加入96孔培養板，每孔100 μL(約3 500個細胞/孔)。將培養板置37 ℃、5% CO2培養箱中培養過夜。用DMEM完全培養基倍比稀釋藥物，按每孔100 μL的量將其加入相應孔中(每個藥物濃度設置6個復孔)，置37 ℃、5% CO2培養箱中分別繼續培養24、48、72 h。吸除培養基，加MTT試劑(終濃度0.2 g·L-1)，37 ℃、5% CO2培養箱中培養4 h后，吸除培養液，每孔加入DMSO 150 μL, 低速振蕩15～30 min，待結晶物充分溶解后，在全波長酶聯免疫檢測儀上測量各孔的OD490值。細胞生長抑制率計算公式：抑制率/%=[1-(藥物處理組OD值-試劑對照孔OD值)/(無藥物處理組OD值-試劑對照孔OD值)]×100%。藥物的IC50值經由GraphPad Prism5統計軟件計算得出。

2.2Transwell法分析細胞遷移分別收取不同濃度藥物處理的細胞，用無血清DMEM培養液調整細胞濃度至4×108·L-1。向Transwell小室中加入無血清DMEM培養基(50 μL/小室)，37 ℃平衡5 min。將調整好濃度的細胞懸液垂直緩慢加入小室中(100 μL/小室)，并將小室置于加有600 μL DMEM完全培養基的培養板下室中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h。取出小室，PBS清洗小室2～3次。將小室置于800 μL固定液中，室溫固定30 min，PBS清洗小室2～3次。將小室置于800 μL結晶紫染色溶液中，室溫染色30 min，清水清洗3～4遍后，吸干小室內液體，用蘸濕的棉棒輕輕擦去上室內部細胞，PBS清洗小室2～3次。將小室小心放置于滴有PBS的干凈玻片上，顯微鏡下隨機取3個視野進行拍照，并計數細胞。

2.3 Transwell法分析細胞侵襲向Transwell小室加入無血清DMEM培養基(50 μL/小室)，37 ℃平衡5 min后棄去。將基質膠原液用無血清DMEM培養基1∶8稀釋后，垂直加入小室中(80 μL/小室)，置37 ℃、4 h靜待其凝固。分別收取不同濃度藥物處理的細胞，用無血清DMEM培養基調整細胞濃度至2.5×108·L-1。將調整好濃度的細胞懸液垂直緩慢加入小室中(100 μL/小室)，并將小室置于加有600 μL DMEM完全培養基(含12%小牛血清)的培養板下室中。37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h。余下操作同上述細胞遷移分析。

2.4 Western blot法檢測蛋白表達分別收取經不同濃度藥物處理的細胞，用含蛋白酶抑制劑的RIPA液裂解細胞(100 μL/孔)后，12 000 r·min-1、4 ℃離心15 min，將上清轉移至新的EP管。用BCA法測定細胞裂解液中的蛋白濃度，取適量上清液(含50 μg蛋白)，加入1/4體積的5×loading buffer，100 ℃保溫10 min。所得樣品經SDS-PAGE分離，電轉移至PVDF膜。膜用5%脫脂牛奶(TBST配制)室溫封閉2 h后，TBST洗膜10 min×3次。加一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜10 min×3次；再加二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min×3次，最后用ECL化學發光法顯影并記錄結果。

2.5 流式細胞術檢測細胞周期分別收取不同濃度藥物處理的細胞，1×PBS洗滌細胞1次，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清。用4 ℃預冷的75%乙醇(1×PBS配制)重懸細胞，固定過夜。2 000 r·min-1離心5 min，棄上清，用1 mL 1×PBS重懸細胞，2 000 r·min-1離心5 min，棄上清。細胞沉淀用500 μL 1×PBS(含50 mg·L-1RNase和0.1% TritonX-100)重懸，加20 μL 0.5 g·L-1PI，37 ℃水浴避光染色30 min。細胞樣本過濾后，上流式細胞儀分析。

2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡分別收集藥物處理后的細胞，PBS洗滌1次，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清。參照試劑盒說明書，每個樣品用100 μL Binding Buffer重懸細胞后，分別加入Annexin Ⅴ-FITC(5 μL/管)和PI Staining Solution(5 μL/管)。充分混勻，避光靜置10 min。每管加入400 μL Binding Buffer，輕輕混勻，1 h內進行流式細胞儀分析。

2.7 流式細胞術分析細胞線粒體膜電位檢測收集相應處理后細胞于EP管中，用PBS洗洗滌細胞1次，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清。預先將Dioc6儲存液用無血清DMEM培養基稀釋至工作濃度(40 nmol·L-1)，每管用1 mL Dioc6工作液重懸細胞。避光37 ℃、20 min，中途彈懸1次。然后以1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，用PBS洗滌細胞1次，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清。每管用500 μL PBS重懸細胞后，進行流式細胞儀分析。

2.8 qPCR檢測mRNA的表達用1 mL TRIzol試劑裂解培養于6孔板中的細胞，并將細胞裂解液轉移至EP管中，每管加入氯仿300 μL，渦旋震蕩15 s，冰置10 min，13 000 r·min-1、4 ℃離心10 min。將上清轉移至新的EP管，每管加入異丙醇300 μL，顛倒混勻。冰置15 min，13 000 r·min-1、4 ℃離心10 min。棄上清，用75%的乙醇(DEPC水配制)600 μL洗滌沉淀，13 000 r·min-1、4 ℃離心10 min。該步驟重復操作一遍。棄去上清液，在無菌臺內靜置10 min待殘余乙醇揮發，每管加入20 μL DEPC-水溶解RNA沉淀。參照逆轉錄試劑盒說明書操作，將樣品中的mRNA逆轉錄成cDNA。然后以β-actin為內參基因，實時定量PCR法檢測目標mRNA的相對表達水平。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequence of LSD1 and β-actin

3 結果

3.1 LDM能有效抑制宮頸癌Hela細胞增殖LDM(0、5、10、20、40、80 μg·L-1)處理Hela細胞24、48、72 h，MTT法檢測分析LDM對細胞增殖的影響，每組設置6個復孔。Fig 1結果顯示，LDM對宮頸癌Hela細胞的增殖有明顯性抑制作用，且呈濃度與時間依賴性。經GraphPad軟件統計分析，LDM對Hela細胞的IC50(95%可信區間)值為：24 h組，19.24 μg·L-1(7.684～48.16 μg·L-1)；48 h組，6.678 μg·L-1(3.494～12.76 μg·L-1)；72 h組，3.221 μg·L-1(1.397～7.429 μg·L-1)。

Fig 1 Proliferation of Hela cells inhibited by LDM

Fig 2 Hela cells arrested by LDM on G2/M stage

Fig 3 Effect of LDM on apoptosis of Hela cells

3.2 LDM誘導宮頸癌Hela細胞發生G2/M周期阻滯LDM(0、5、20 μg·L-1)處理細胞24 h后，收集細胞進行流式細胞分析。結果顯示，與對照組相比，LDM處理組G1期、S期細胞比例降低，G2期細胞比例明顯性增加，提示LDM能將Hela細胞周期阻滯在G2/M期，并且呈濃度依賴性(Fig 2A)。Western blot結果也顯示, 與對照組相比，LDM處理組的細胞周期相關因子Cyclin B1與p21表達升高，而Cyclin D1表達降低，且呈濃度依賴性(Fig 2B)。該結果進一步驗證LDM能通過對細胞周期相關蛋白因子表達的影響，改變Hela細胞周期和抑制細胞增殖。

Fig 4 Effect of LDM on expression of apoptosis-related proteins and change of MMP of Hela cells

3.3 LDM誘導宮頸癌Hela細胞凋亡LDM(0、5、10、20、40、80 μg·L-1)處理細胞24、48 h后，收集細胞進行流式細胞分析。結果顯示，LDM能有效誘導Hela細胞發生凋亡，且呈濃度依賴性。與對照組相比，LDM處理24 h的細胞凋亡率從3.87%增加到11.38%；而LDM處理48 h的細胞凋亡率從4.27%增加到29.54%(Fig 3)。Western blot分析結果顯示，與對照組相比，LDM處理組(24 h)的細胞中凋亡底物蛋白PARP的切割活化產物蛋白(c-PARP)與凋亡促進蛋白Bax表達增加，但凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達下降，Bax/Bcl-2的比值明顯升高，且以上變化均呈濃度依賴性(Fig 4A)。

線粒體膜通透性增加和膜電位下降是線粒體途徑細胞凋亡發生的早期事件之一。為了進一步驗證LDM對宮頸癌Hela細胞的細胞凋亡的誘導作用，本實驗用LDM(0、5、20 μg·L-1)處理細胞48 h后，收集細胞并用Dioc6染色，然后用流式細胞術檢測細胞內線粒體膜電位的變化。結果顯示，與對照組相比，LDM處理組的細胞綠色熒光強度均值增加，峰頂值右偏，且高濃度組較低濃度組變化更明顯，提示LDM處理可導致線粒體膜通透性增加和膜電位降低(Fig 4B)。

3.4 LDM影響宮頸癌Hela細胞自噬用LDM(0、5、20 μg·L-1)處理細胞24 h后，制備細胞裂解液進行Western blot分析。結果顯示，與對照組相比，低濃度LDM處理使自噬底物蛋白p62蛋白表達水平下降，而自噬標志蛋白Beclin-1和LC3B表達水平升高；但高濃度LDM處理時，p62蛋白表達水平無明顯改變，而Beclin-1和LC3B的表達水平明顯下降(Fig 5)。提示LDM在低濃度時可使Hela細胞自噬水平增加，而在高濃度時可降低Hela細胞的自噬水平。

3.5 LDM抑制宮頸癌Hela細胞遷移和侵襲分別用LDM(0、5、10、20、40、80 μg·L-1)處理對數生長期的Hela細胞24 h，然后用Transwell法分析細胞的遷移能力。結果顯示，LDM能明顯抑制宮頸癌Hela細胞的遷移能力，且呈濃度依賴性(Fig 6A、6C)。進一步分析LDM對Hela細胞侵襲能力影響。用LDM(0、5、20 μg·L-1)處理對數生長期的Hela細胞24 h后，基質膠-Transwell法分析細胞的侵襲能力。結果顯示，LDM能夠有效抑制宮頸癌Hela細胞侵襲，且呈濃度依賴性(Fig 6B、6D)。

隨后分析LDM對Hela細胞內EMT相關因子表達的影響。用LDM(0、5、20 μg·L-1)處理細胞24 h后，制備細胞裂解液，Western blot法分析細胞內EMT相關蛋白表達的水平。結果顯示，與對照組相比，LDM處理組細胞的上皮細胞標志蛋白E-cadherin表達升高，間質型細胞標志蛋白N-cadherin與Vimentin表達降低，且高濃度組較低濃度組變化更明顯；與對照組相比，LDM處理細胞中基質金屬蛋白酶MMP-2與MMP-9表達降低，且高濃度組較低濃度組變化更明顯(Fig 7)。上述結果提示，LDM能夠抑制宮頸癌Hela細胞發生EMT和抑制細胞侵襲轉移。

Fig 5 Effect of LDM on autophagy of Hela cells n=3)

3.6 LDM對宮頸癌Hela細胞內LSD1表達水平無明顯影響用LDM(0、5、20 μg·L-1)處理細胞24 h后，分析細胞內LSD1 mRNA和蛋白的表達。Fig 8結果顯示，與對照組細胞相比，LDM處理組細胞的LSD1 mRNA及蛋白表達水平無明顯改變。

4 討論

腫瘤細胞對LDM處理的反應，因其組織來源和遺傳背景不同而有所差異。目前報道的LDM抑制腫瘤細胞增殖和殺傷腫瘤細胞的機制主要包括：① 與腫瘤細胞DNA雙螺旋的小溝結合，引起DNA雙鏈斷裂和脫堿基化，從而抑制細胞增殖；② 抗腫瘤血管生成；③ 誘導腫瘤細胞發生凋亡、裂亡，以及出現衰老樣表型；④ 誘導腫瘤細胞發生G1或G2/M細胞周期阻滯；⑤ 干擾與腫瘤生長相關信號通路的活性，如K-ras、Akt、NF-kB和MAPK信號通路等[2]。

本研究發現，LDM在低濃度下即能高效抑制Hela細胞的增殖，處理24、48、72 h的IC50值分別為19.24、6.678、3.221 μg·L-1。細胞周期分析發現，LDM能將Hela細胞阻滯于G2/M期，同時上調細胞周期調控因子Cyclin B1和p21，但下調Cyclin D1的表達水平。在高濃度處理組(20 μg·L-1)細胞中，上述現象尤為明顯。這一結果提示，LDM導致細胞周期調控因子異常表達可能是其抑制細胞周期的重要分子基礎[2,3]。

Fig 6 Effect of LDM on migration and invasion abilities of Hela cells

細胞的凋亡與自噬分別被稱為細胞的I型程序性死亡和Ⅱ型程序性死亡[4]。本研究發現，LDM可誘導Hela細胞發生凋亡，表現為LDM可使細胞中凋亡底物蛋白PARP的切割活化產物c-PARP與凋亡促進蛋白Bax表達增加，而凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達下降，Bax/Bcl-2的比值明顯升高，且以上變化均表現出濃度依賴性。進一步對線粒體膜電位的分析提示，LDM能誘導Hela細胞發生線粒體依賴性的內源性細胞凋亡。

Fig 7 Effect of LDM on EMT-related proteins in Hela cells

LDM對Hela細胞自噬的影響因藥物濃度的不同而有所差異，低濃度LDM(5 μg·L-1)能誘導Hela細胞發生自噬，這可能是藥物應激條件下細胞的自我保護性反應。但在高濃度(20 μg·L-1)時，LDM能明顯抑制Hela細胞的自噬能力，由此導致的應激保護能力下降可能進一步增強Hela細胞對藥物的敏感性，對自噬的抑制可能與高濃度LDM能更明顯地抑制細胞增殖、抑制細胞周期和誘導細胞凋亡密切相關。

侵襲和遷移是所有惡性腫瘤的特征性生物學行為，其過程機制復雜，密切關系著疾病的發展與預后。腫瘤細胞的上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，即具有上皮表型的腫瘤細胞轉化為具有間充質表型的腫瘤細胞，是上皮腫瘤獲得侵襲轉移能力、以及藥物抗性的關鍵性步驟，由此成為抗癌治療的重要靶點[5-7]。本研究發現，LDM對宮頸癌Hela細胞的侵襲和遷移能力均有明顯抑制作用，且呈濃度依賴性。LDM可上調Hela細胞中上皮細胞標志蛋白E-cadherin，但抑制間質型細胞標志蛋白N-cadherin與Vimentin的表達水平，同時使具有促侵襲轉移功能的基質金屬蛋白酶MMP-2與MMP-9表達降低，且高濃度藥物處理的細胞中上述變化更為明顯。上述結果提示，LDM能夠抑制宮頸癌Hela細胞發生EMT和抑制細胞侵襲和轉移。

Fig 8 Effect of LDM on expression of LSD1 mRNA(A)and protein(B, C) of Hela cells

有研究發現，賴氨酸特異性去甲基化酶1(lysine specific demethylase 1，LSD1)能結合到E-cadherin基因的啟動子上，并與HDAC1/2、PRC2、G9a、Suv39H1和DNA甲基轉移酶等因子協同作用，引起的該基因表達沉默[8-9]。這提示LSD1在介導E-cadherin基因表達沉默過程中發揮重要作用，而敲除LSD1基因能逆轉其對E-cadherin基因的轉錄抑制作用，進而上調E-cadherin的表達水平[10-11]。

為探索LSD1是否也在LDM誘導Hela細胞發生EMT的過程中發揮作用，本研究分析了LDM對宮頸癌Hela細胞中LSD1表達的影響。結果發現，LDM對Hela細胞中LSD1的表達水平無明顯影響。提示LDM對宮頸癌Hela細胞EMT的抑制作用與LSD1無關，LDM上調Hela細胞中E-cadherin基因表達的機制有待進一步研究。

綜上所述，本研究結果證明，LDM能夠有效抑制宮頸癌Hela細胞的增殖和侵襲轉移，其作用機制可能與阻遏細胞周期、誘導細胞凋亡、干擾細胞自噬和抑制EMT密切相關。上述研究結果提示，LDM有用于宮頸癌臨床治療的潛在價值，該研究為LDM的臨床應用提供了基礎研究支撐。