AZD8055抑制膽管癌細胞HuCCT1的遷移及EMT進程的機制研究

王 雪，畢宇寧，閆文帝，張 鑫，董 穎，匡子藤，林貞花，任香善

(延邊大學1. 腫瘤研究中心、2. 醫學院病理學教研室、3. 吉林省科技廳重點實驗室,吉林 延吉 133002)

膽管癌是源自膽管上皮細胞的惡性腫瘤，具有易發生轉移、預后差等特點[1]。目前，其治療手段以外科手術切除為主，輔以放化療[2]，但常規放化療方法具有毒副作用大、易耐藥等缺點。近年來，分子靶向治療是一種快速發展的治療方法，可特異性的結合腫瘤細胞并誘導其凋亡，但不會傷及腫瘤周圍的正常組織細胞，因此，分子靶向治療也被稱為“生物導彈”。

研究表明[3]，在膽管癌中，Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路異常激活，并與腫瘤的侵襲和轉移等惡性進程呈正相關。mTOR在體內以mTORC1和mTORC2兩種復合物的方式存在[4]。研究發現，mTORC1的特異性靶向藥物雷帕霉素，易出現負反饋作用，導致Akt的磷酸化[5]。AZD8055是一種新型的mTORC1和mTORC2雙重抑制劑(結構見Fig 1A)，能有效抑制mTORC1復合物引起的Akt負反饋活性。在肝癌、神經母細胞瘤等多種腫瘤中，AZD8055通過抑制細胞增殖和/或誘導細胞凋亡，從而達到抗腫瘤作用[6-8]，但在膽管癌中的抗腫瘤作用及其分子機制尚未見報道。

原癌基因DEK是一種染色質調節蛋白，在膽管癌中呈高表達[9]，可通過調節Akt/mTOR信號通路、轉錄因子等多種途徑，促進腫瘤細胞生長、浸潤等過程[10-11]，提示DEK可作為抗腫瘤的靶點。因此，本研究旨在探討AZD8055對膽管癌細胞HuCCT1的抑制作用，闡明其分子機制，為膽管癌的臨床治療提供新的實驗依據及理論基礎。

1 材料

1.1 細胞株人膽管癌HuCCT1細胞，購自美國模式培養物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC)細胞庫。

1.2 試劑AZD8055，購自美國Selleck Chemicals公司(批號：S1555)，用DMSO配制成1 mmol·L-1的濃縮液，分裝保存于-20 ℃冰箱；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、Opti-MEM培養基，均購自美國Gibco公司；RPMI 1640培養基，購自美國Corning公司；p-4EBP1、4EBP1、p-S6、S6、p-Akt、Akt、上皮型鈣黏蛋白(E-Cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、轉錄因子Snail抗體，均購自美國Cell Signaling Technology公司；DEK抗體，購自美國BD公司；β-actin抗體，購自美國Abcam公司；MTT、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，均購自美國Amresco；吉姆薩(Gimesa)染色液，購自日本Wako；DEK小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)試劑，購自廣州市銳博生物科技有限公司；Lipo 3000購自美國Invitrogen。

1.3 儀器光學倒置相差顯微鏡、奧林巴斯BX53顯微鏡(日本Olympus公司)；全波長多功能酶標儀(瑞士Tecan公司)；凝膠成像儀、電泳儀(Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 細胞培養HuCCT1細胞用RPMI 1640完全培養液(含10% FBS和1%青-鏈霉素)培養，于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中常規培養。

2.2 MTT實驗取對數生長期的HuCCT1細胞，以5×103個(100 μL)接種于96孔板，實驗設置對照組、AZD8055組(50、100、200、400 nmol·L-1)，每組設置6個平行孔。每組細胞培養24、72、120 h后，每孔加入100 μL MTT(1 g·L-1)溶液，繼續培養4 h，小心吸棄上清，加入100 μL的DMSO充分振蕩，用全波長分光光度計，在490 nm處檢測吸光度(OD)值。AZD8055對HuCCT1細胞的生長抑制率=(1-用藥組OD值/對照組OD值)×100%。

2.3 平板集落形成實驗取對數生長期的HuCCT1細胞，以每孔100個的細胞密度接種于6孔板中，次日更換為完全培養液及分別含AZD8055(25、50、100 nmol·L-1)的培養液，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養14 d，肉眼可見含有50個以上的細胞集落時，用PBS緩沖液清洗2次，室溫下4%多聚甲醛固定，Giemsa染液染色，自然干燥后，進行拍照，用ImageJ軟件進行分析。

2.4 劃痕愈合實驗取對數生長期的細胞接種于6孔板中，待細胞生長至80%～ 90%融合后，用不含血清的培養液饑餓處理細胞6～8 h。用200 μL的滅菌槍頭呈“1”字形進行劃痕，PBS清洗后，對照組和用藥組分別更換為完全培養液和濃度為100、200、400 nmol·L-1的AZD8055工作液，繼續培養，在0、12 h拍照，記錄劃痕寬度，根據公式計算劃痕愈合率：劃痕愈合率=(0 h劃痕寬度-12 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

2.5 Transwell小室遷移實驗取對數生長期的HuCCT1細胞，用含1% FBS的培養液制備2×109·L-1的細胞懸液，取100 μL接種于Transwell小室中，待細胞貼壁后，上室分別加入用1% FBS配制的培養液及AZD8055工作液(100、200、400 nmol·L-1)，下室加入600 μL含10% FBS的完全培養液。繼續培養24 h后，取出小室用4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，雙蒸水脫色，棉簽擦凈未遷移的細胞，將小室薄膜切下，鋪于載玻片，封片，拍照觀察并統計。

2.6 數據庫分析登陸STITCH在線數據庫(http://stitch.embl.de)，選擇Multpile names，輸入DEK基因及AZD8055，選擇人類種屬Homo Sapiens，確認信息后即可顯示分析結果；登陸GeneMANIA在線數據庫(http://www.genemania.org)，選擇人類種屬Homo Sapiens，輸入DEK、Akt/mTOR信號通路的相關基因，確認信息后即可顯示分析結果。

2.7 Western blot實驗細胞常規培養，消化接種于60 mm培養皿，待細胞貼壁后，分別用AZD8055工作液(0、100、200、400 nmol·L-1)處理24 h后提取總蛋白，待檢測Akt/mTOR信號通路及DEK蛋白；常規細胞培養，用AZD8055(0、400 nmol·L-1)分別處理0、6、12、24 h后提取總蛋白，待檢測EMT相關蛋白。收集各組細胞，用TEPER裂解液提取總蛋白，BSA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，取40 μg蛋白行8%～10% SDS-PAGE電泳，電轉至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，次日，洗膜，加HRP標記二抗(1∶3 000)室溫孵育2 h，ECL法顯影、曝光，用ImageJ軟件進行分析。

由此,通過增加電路狀態方程的階數,解決了改進型文氏橋混沌振蕩器的數學建模問題。在式(2)中引入新的無量綱變量,并對電路參數作歸一化處理,即

2.8 siRNA基因沉默實驗取對數生長期的細胞接種于6孔板，分別設control組、negative control(NC)組及si-DEK組，次日待細胞生長至30%～50%，control組加入2 mL正常完全培養液，negative control組與si-DEK組分別加入含2 mL混合液(含1.74 mL的無雙抗有血清RPMI 1640培養液、250 μL Opti-MEM培養基、5 μL的Lipo 3000和5 μL的50 nmol·L-1的siRNA)，繼續培養48 h，待確認沉默效果后，進行MTT實驗、劃痕愈合實驗、Transwell小室遷移實驗、Western blot實驗。本文使用的有效siRNA序列為siDEK4(5′-TGTCCTCATTAAAGAAGA A-3′)。

3 結果

3.1 AZD8055明顯抑制膽管癌細胞增殖活力與集落形成能力MTT結果顯示(Fig 1B)，與對照組相比，AZD8055(50、100、200、400 nmol·L-1)組細胞增殖活性明顯受到抑制，且呈時間-濃度依賴性(P<0.05)。平板集落形成實驗結果提示(Fig 1C)，AZD8055處理HuCCT1細胞14 d后，與對照組相比，AZD8055(25、50、100 nmol·L-1)組細胞克隆形成能力明顯減弱，且呈劑量依賴性(P<0.05)，提示AZD8055可明顯抑制HuCCT1細胞的增殖活性。

3.2 AZD8055抑制膽管癌細胞的遷移能力Fig 2A的劃痕愈合實驗結果發現，AZD8055(100、200、400 nmol·L-1)作用細胞12 h后，與對照組相比，藥物處理組細胞橫向遷移距離明顯縮短。Fig 2B的Transwell實驗結果發現，AZD8055(100、200、400 nmol·L-1)處理HuCCT1細胞24 h后，其縱向細胞遷移能力明顯受到抑制(P<0.05)，提示AZD8055可抑制膽管癌細胞的橫向及縱向遷移能力。

3.3 AZD8055抑制Akt/mTOR信號通路相關蛋白的表達及EMT進程Western blot結果顯示，AZD8055(100、200、400 nmol·L-1)作用于膽管癌細胞24 h后，Akt/mTOR信號通路相關蛋白Akt、S6、4EBP1蛋白的磷酸化水平明顯下降(Fig 3A)。經400 nmol·L-1的AZD8055處理6、12、24 h后，上皮標志物E-cadherin蛋白表達升高，間質標志物Vimentin、Snail蛋白表達下降(Fig 3B)，提示AZD8055抑制Akt、S6、4EBP1的磷酸化水平及EMT進程。

3.4 AZD8055通過調控DEK抑制膽管癌細胞的增殖及遷移能力為了檢測AZD80055抑制膽管癌細胞的增殖和遷移的機制，用STITCH數據庫分析AZD8055與DEK蛋白之間的相關性(Fig 4A)。STITCH數據庫分析結果顯示，AZD8055與DEK蛋白之間具有相關性。以上提示，DEK蛋白可作為AZD8055與Akt/mTOR信號通路的樞紐蛋白，參與AZD8055抑制膽管癌細胞HuCCT1的增殖、遷移及EMT進程的調控過程。

Western blot結果發現，AZD8055(100、200、400 nmol·L-1)作用于膽管癌細胞24 h后，DEK蛋白表達明顯受到抑制(Fig 4B)，表明AZD8055可調控DEK蛋白的表達，與STITCH數據庫結果一致。篩選DEK基因沉默序列，結果表明，si-DEK4沉默效果最為明顯(Fig 4C)，后續實驗選擇si-DEK4作為沉默序列。基因沉默48 h后，膽管癌細胞的增殖能力與遷移能力明顯受到抑制(P<0.05)(Fig 4D～4F)，提示AZD8055可靶向DEK蛋白，抑制膽管癌的增殖與遷移。

Fig 1 Effect of AZD8055 treatment on proliferation and colony of HuCCT1 cells

Fig 2 Influence of AZD8055 on HuCCT1 cell migration

Fig 3 Blockade of Akt/mTOR pathway and process of EMT by AZD80055 in HuCCT cells

Western blot結果顯示，DEK基因沉默48 h后，Akt、S6、4EBP1蛋白的磷酸化表達水平明顯下調(Fig 5B)，且上皮標志物E-cadherin表達上調，間質標志物Vimentin、Snail表達下調(Fig 5C)。上述結果提示，AZD8055靶向DEK，抑制Akt/mTOR信號通路的磷酸化水平，并抑制膽管癌細胞的EMT進程。

4 討論

膽管癌是消化道惡性程度較高的腫瘤，死亡率居高不下[1]。多項研究證實，AZD8055可作為一種新型抗腫瘤藥物，通過抑制增殖與誘導凋亡，達到良好的體內外抗腫瘤作用[4,12]。本實驗通過MTT法檢測AZD8055對膽管癌細胞HuCCT1增殖的影響，結果顯示，不同濃度的AZD8055能夠有效抑制膽管癌的增殖活性，呈劑量-時間依賴性；進一步的克隆結果顯示，AZD8055可以明顯減少HuCCT1細胞的集落數量。李鵬等[7]的研究表明，AZD8055可以通過調節AMPK蛋白的磷酸化水平，抑制肝癌細胞的增殖和克隆形成能力。劃痕愈合實驗和Transwell小室遷移實驗結果顯示，AZD8055明顯抑制膽管癌細胞的橫向與縱向遷移能力。這與Giubellino等[13]的研究中，AZD8055可以通過Akt/mTOR信號通路，抑制嗜鉻細胞瘤遷移能力的結果相一致。

Akt/mTOR信號通路是腫瘤發生的一個重要信號通路，在多種腫瘤中異常激活[14]，與腫瘤細胞的增殖、凋亡、自噬與轉移等過程密切相關。Western blot結果顯示，AZD8055處理細胞后，Akt、S6和4EBP1的蛋白磷酸化水平均受到明顯抑制，提示AZD8055可通過抑制Akt/mTOR信號通路，調控HuCCT1細胞的凋亡、增殖和遷移。

DEK作為一種原癌基因參與多種生物進程，如增殖、衰老、凋亡、分化和轉化蛋白。通過STITCH數據庫分析結果顯示，AZD8055與DEK蛋白之間具有相關性。進一步的GeneMANIA數據庫發現，DEK與Akt/mTOR信號通路存在交互關系。本實驗結果表明，不同濃度AZD8055處理HuCCT1細胞24 h后，可明顯抑制DEK蛋白的表達水平，而沉默DEK基因明顯抑制了Akt、S6、4EBP1蛋白的磷酸化表達水平，并明顯降低膽管癌細胞增殖及遷移。Wu等[11]研究證實，下調DEK基因抑制胰腺導管癌的增殖和轉移，與我們的研究結果相符。本課題組前期的研究證實，DEK作為Akt的上游因子，參與和調控Akt信號通路[9]。

EMT是指上皮細胞失去細胞極性向間質細胞表型轉化的現象。當細胞發生癌變時，上皮細胞間的細胞連接減弱，從而促進細胞遷移和侵襲能力。N?rz等[15]的研究結果發現，AZD8055聯合MK-2206可抑制Akt/mTOR信號通路的活性，從而抑制黑色素瘤細胞的EMT進程。本研究結果也顯示，膽管癌細胞經AZD8055處理后，E-cadherin表達上調，Vimentin、Snail表達下調。Yang等[16]的研究證明，沉默乳腺癌細胞中的DEK基因后，E-cadherin表達上調，Vimentin、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)中的MMP-2和MMP-9表達下調。本實驗結果表明，當HuCCT1細胞中DEK基因沉默后，上皮標志物E-cadherin表達上調，間質標志物Vimentin、Snail表達下調。

綜上所述，AZD8055可有效抑制HuCCT1膽管癌細胞的遷移及EMT進程，這與降低DEK蛋白表達水平，抑制Akt/mTOR信號通路相關。本研究將為AZD8055應用于膽管癌的臨床治療提供新的理論依據。

Fig 4 Proliferation and migration of cholangiocarcinoma cells inhibited by AZD8055 via regulating DEK gene

Fig 5 AZD8055 targets DEK to regulate Akt/mTOR signaling pathway to inhibit EMT progress of cholangiocarcinoma cells