姜黃素-PLGA納米粒的制備及誘導膠質瘤細胞凋亡的實驗研究

胡興華，張峻槐，黃禮義，徐忠燁

(重慶醫科大學附屬第二醫院1. 神經外科、2.康復醫學科，重慶 400010)

腦膠質瘤是顱內最常見的原發惡性腫瘤，占顱內腫瘤的45%[1]。目前，腦膠質瘤的主要治療方式為手術、放療和化療[2]，然而這些治療手段并不能完全消除腫瘤，且創傷大、副作用明顯。手術切除的方式能夠治愈小部分低級別腦膠質瘤患者，但是，大部分的腦膠質瘤患者在接受手術、輔以放化療等綜合治療后仍易復發。腦膠質瘤的總體療效有待進一步提高，尋找安全有效且毒副作用小的抗腫瘤方法迫在眉睫。

姜黃素(curcumin，CUR)是從姜科植物中提取的一種相對分子質量小的黃色多酚類物質，是姜黃的主要成分。大量的研究證明，姜黃素具有抗癌、抗氧化、抗炎、清除自由基等多種藥理作用，并且對多種惡性腫瘤，如肺癌[3]、前列腺癌[4]、宮頸癌[5]、乳腺癌[6]等均有不同程度的抑制作用，與傳統化療藥物相比毒副作用更小，使其成為極具潛力的抗腫瘤藥物，美國國立腫瘤所已將其列為第3代化學防癌藥[7]。但是，姜黃素存在水溶性差、難吸收、易降解、代謝快等缺點，導致其生物利用度低[8]，使其在基礎和臨床中的應用受阻。近年來，可生物降解聚合物在藥物的控制和靶向傳遞中發揮了重要作用，目前研究較多的合成生物降解聚合物之一的乳酸-乙醇酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA]是一種有機高分子化合物，具有良好的生物相容性和安全性，其優良的成囊和成膜性能為藥物傳遞系統提供了良好的支持，大量基于PLGA的藥物傳遞系統已經被報道用于治療或診斷各種疾病。為了改善姜黃素的生物利用度，本實驗采用PLGA作為原材料制備姜黃素-PLGA納米粒，對其理化性質進行檢測，并觀察其對鼠源性膠質瘤C6細胞和人源性膠質瘤U251細胞的抗腫瘤作用，期望為膠質瘤的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞與試劑 鼠源性膠質瘤C6細胞株、人源性膠質瘤U251細胞株，由重慶醫科大學生命科學院惠贈。高糖DMEM，購自美國Gibco公司；青霉素-鏈霉素、二甲基亞砜(DMSO)、CCK-8試劑盒、Hoechst 33342，購自上海碧云天生物公司；胎牛血清，購自德國PAN生物公司；姜黃素、PLGA、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)，購自美國Sigma公司；二氯甲烷，購自成都市科隆化學品有限公司； Annexin V-FITC/PI，購自天津三箭生物技術股份有限公司。

1.1.2儀器 VCY-500聲震儀(上海研永超聲設備有限公司)；恒溫磁力攪拌器、SB-5200DTDN超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；動態光散射激光粒度測定儀(英國Malvern公司)；Varioskan LUX酶標儀(美國Thermo Scientific公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；H-7500透射電子顯微鏡(TEM，日本Hitachi公司)；流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 細胞培養及分組U251細胞株、C6細胞株均使用添加有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養基，并置于37 ℃、5% CO2環境下的細胞孵箱中培養。細胞實驗分為空白對照組、姜黃素組和姜黃素-PLGA(100 μmol·L-1)組。待細胞貼壁后，棄培養基，PBS洗2次，姜黃素-PLGA組加入含姜黃素-PLGA納米粒的新鮮培養基，姜黃素組加入含姜黃素的新鮮培養基，空白對照組更換為新鮮培養基，數小時后進行各項檢測。

1.3 姜黃素-PLGA納米粒的制備分別稱取50 mg PLGA、2 mg姜黃素，溶于2 mL二氯甲烷中，超聲波清洗機溶解；加入5 mL預冷的4% PVA，混勻，在冰水浴條件下超聲乳化2 min(150 W，5 s/5 s)；將乳化后的溶液在通風櫥中磁力攪拌2 h，使有機溶劑二氯甲烷充分揮發，離心沉淀即姜得黃素-PLGA納米粒。

1.4 姜黃素-PLGA納米粒的表征取適量姜黃素-PLGA納米粒溶液，蒸餾水適當稀釋，于常溫條件下固定激光波長為632.8 nm、散射角90°，使用動態光散射激光粒度測定儀(dynamic light scattering，DLS)檢測納米粒的粒徑。倒置熒光顯微鏡觀察姜黃素-PLGA納米粒的形態。透射電鏡觀察姜黃素-PLGA納米粒的形態，取適量姜黃素-PLGA納米粒溶液滴于覆蓋有碳膜的銅網上，用濾紙沿銅網邊緣吸除多余液體，滴入2%磷鎢酸染色，自然晾干2 d，置于TEM中，以100 kV加速電壓檢視、拍照。多功能酶標儀測定姜黃素及姜黃素-PLGA納米粒的吸收波長。

1.5 姜黃素-PLGA納米粒的載藥量及包封率測定多功能酶標儀測定姜黃素濃度：取1 mg姜黃素溶于DMSO中，梯度稀釋為0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g·L-1，離心洗滌姜黃素-PLGA納米粒時，收集上清，將上述濃度的姜黃素溶液和收集的上清加入96孔板中，每組3個復孔，測定421 nm下各孔的吸光度，繪制標準曲線，計算上清液中姜黃素的含量。應用下列公式計算：包封率/%=(姜黃素總量-上清中姜黃素含量)/姜黃素總量×100%；載藥率=(姜黃素總量-上清中姜黃素含量)/PLGA總量×100%。

1.6 熒光顯微鏡觀察C6細胞、U251細胞對姜黃素-PLGA納米粒的攝取C6細胞、U251細胞接種于6孔板(5×105個/孔)，各組分別接受上述干預措施處理24 h后，使用4%多聚甲醛固定5 min，PBS洗滌2次后加入0.1% Triton X-100破膜5 min，再用PBS洗滌2次后，使用10 mg·L-1Hoechst 33342染色5 min，洗掉染色液后滴加抗熒光淬滅封片液，使用熒光顯微鏡觀察并照相。

1.7 CCK-8檢測姜黃素-PLGA納米粒對C6細胞、U251細胞的細胞毒性將C6細胞、U251細胞接種于96孔板中，每孔5×103個細胞，每組3個復孔，經上述分組處理后避光孵育24 h，每孔加入100 μL含10% CCK-8試劑的無血清高糖DMEM培養基避光培養，酶標儀檢測波長為450 nm時的OD值。陰性對照組為含CCK-8試劑的無血清高糖DMEM培養基和細胞，空白對照組為含CCK-8試劑的無血清高糖DMEM培養基，不含細胞和毒性物質。細胞存活率=(實驗組OD值-空白對照組OD值)/(陰性對照組OD值-空白對照組OD值)×100%。

1.8 Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡率將C6細胞、U251細胞種于6孔板中(1×105個/孔)，經上述分組處理24 h后，收集所有的懸浮和貼壁細胞于EP管中，1 000 r·min-1離心5 min，PBS洗滌細胞3次，重懸后采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡率。

1.9 Hoechst 33342染色觀察細胞凋亡將C6細胞、U251細胞接種于6孔板(5×105個/孔)，各組分別接受上述干預措施處理24 h后，使用4%多聚甲醛固定5 min，PBS洗滌后加入0.1% Triton X-100破膜5 min，PBS洗滌后，使用10 mg·L-1Hoechst 33342染色5 min，洗掉染色液后滴加抗熒光淬滅封片液，使用熒光顯微鏡觀察并照相。

2 結果

2.1 姜黃素-PLGA納米粒的表征姜黃素-PLGA納米粒呈黃色，倒置熒光顯微鏡下和透射電鏡下觀察姜黃素-PLGA納米粒呈球形(Fig 1A、1B)，其平均粒徑為(284.6±9.0)nm(Fig 1C)，其吸收波長為421 nm(Fig 1D)，而姜黃素的吸收波長為421 nm，證明PLGA成功包載了姜黃素。

2.2 姜黃素-PLGA納米粒的包封率和載藥率姜黃素-PLGA納米粒的包封率為(70.712±2.615)%，載藥率為(2.828±0.105)%。

2.3 細胞對姜黃素-PLGA納米粒的攝取如Fig 2所示，姜黃素、姜黃素-PLGA納米粒孵育細胞24 h后，熒光顯微鏡觀察發現，C6細胞和U251細胞對姜黃素-PLGA納米粒的攝取均明顯多于姜黃素(P<0.05)。

2.4 姜黃素-PLGA納米粒對C6細胞、U251細胞的細胞毒性CCK-8檢測結果顯示(Fig 3)，24 h時姜黃素-PLGA組(100 μmol·L-1)的C6細胞及U251細胞活性明顯低于空白對照組和姜黃素組(P<0.05)。

2.5 姜黃素-PLGA納米粒促進C6細胞、U251細胞凋亡流式細胞術結果顯示(Fig 4)，經上述分組處理24 h后，姜黃素-PLGA組C6細胞及U251細胞的凋亡率明顯高于空白對照組及姜黃素組(P<0.05)；而空白對照組與姜黃素組對比，細胞凋亡差異無統計學意義(P>0.05)。

2.6 Hoechst 33342染色觀察細胞凋亡Hoechst 33342染色結果顯示(Fig 5)，經上述干預措施處理24 h后，與空白對照組相比，姜黃素-PLGA組有明顯的細胞核固縮，深染，凋亡小體形成；與姜黃素組相比，姜黃素-PLGA組也有明顯的細胞核固縮，深染，凋亡小體形成。結果表明姜黃素-PLGA納米粒可以誘導C6細胞、U251細胞凋亡。

3 討論

姜黃素作為一種天然酚類物質，具有良好的抗腫瘤作用，且安全性好，但是其存在易降解、生物利用度低等不足。PLGA是目前應用最廣泛的微膠囊化和延長治療藥物、蛋白質和抗原遞送的生物材料，被廣泛應用于制藥、醫用工程材料和現代化工業領域，被美國食品和藥物管理局(FDA)和歐洲藥物管理局(EMA)等國際監管機構普遍認為其是安全的。利用腫瘤的高通透性和滯留效應(enhanced permea-bility and retention effect,EPR)，包載藥物的PLGA納米粒可以更好地聚集于腫瘤部位，同時，PLGA能夠延緩肝臟對藥物的直接代謝，延長藥物在血液循環中的存在時間，提高生物利用度并產生緩釋作用，從而更好地發揮藥物的治療效率。本研究以PLGA為原材料，采用乳化-溶劑揮發法成功制備了姜黃素-PLGA納米粒，其大小均勻、粒徑較小，具有良好的生物相容性。本實驗結果表明，相較于單純的姜黃素，姜黃素-PLGA納米粒能夠更好地被C6細胞、U251細胞攝取。在相同藥物濃度下，姜黃素-PLGA納米粒對C6細胞、U251細胞具有更明顯的毒性。

Fig 1 Characterization of curcumin-PLGA nanoparticles

Fig 2 Uptake of curcumin-PLGA nanoparticles in C6 cells and U251 cells(×200)

Fig 3 Effect of curcumin-PLGA nanoparticles on cell viability in C6 cells and U251 cells

凋亡是細胞程序性死亡的一種形式，其結果是有序和有效地清除受損細胞，細胞凋亡可由細胞內的信號(如基因毒性應激)或外部信號(如配體與細胞表面死亡受體的結合)觸發，涉及一系列基因的激活、表達及調控等。凋亡發生時，細胞體積縮小，細胞-細胞連接消失，核濃縮，核膜核仁破碎，最終將凋亡細胞遺骸分割包裹為幾個凋亡小體。細胞凋亡是機體維持自身穩定的重要因素，當機體組織細胞增殖和凋亡失衡，易引發腫瘤。本實驗結果表明，相比于姜黃素組，姜黃素-PLGA組的細胞凋亡率明顯增高，并出現明顯的細胞核固縮、碎裂，表明姜黃素-PLGA納米粒比單純姜黃素更明顯地誘導了C6細胞、U251細胞凋亡。

Fig 4 Effect of curcumin-PLGA nanoparticles on cell apoptosis in C6 cells and U251 cells vs control group

Fig 5 Apoptosis in C6 cells and U251 cells induced by curcumin-PLGA nanoparticle(×200)

姜黃素誘導腫瘤細胞凋亡涉及調控細胞內外多種蛋白家族、蛋白分子和不同的分子通路，并且在不同腫瘤中的凋亡機制也存在差異。既往研究表明，姜黃素可通過凋亡相關蛋白，如caspase3、caspase-9、Bcl-2、Bcl-xL等，調控細胞凋亡[9-12]，也可以通過抑制NF-κB和基質金屬蛋白酶-9，抑制細胞增殖并誘導其凋亡[13]。本實驗中制備的姜黃素-PLGA納米粒是否通過上述通路誘導膠質瘤細胞凋亡，以及是否存在其他凋亡途徑，將在后續實驗中探討。

綜上所述，本實驗成功制備了一種粒徑較小、大小均一、生物相容性高、可生物降解的姜黃素-PLGA納米粒，并證實了相比于單純姜黃素，姜黃素-PLGA納米粒可明顯提高細胞攝取率，誘導腫瘤細胞的凋亡，為腦膠質瘤的治療提供新的思路。

(致謝：本實驗主要在重慶醫科大學超聲影像學研究所、生物醫學工程學院、生命科學院公共實驗平臺完成，并對實驗室郝蘭、曹陽、李崇雁等老師，以及黃禮義、楊強、鐘曉文等同學提供的幫助表示衷心感謝！)