腫瘤KRAS基因突變靶向治療研究進展

姜壯壯，徐婷婷，陶 麗，劉延慶

(揚州大學醫學院，國家中醫管理局胃癌毒邪論治重點研究室，揚州大學醫藥研究所，揚州大學腫瘤防治重點實驗室，江蘇 揚州 225001)

鼠類肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS)的突變是許多腫瘤如結腸癌、胰腺癌、非小細胞肺癌等常見的生物學事件，也是很多腫瘤發病的主要機制之一。KRAS基因突變可導致機體失去GTP水解酶活性, 其致癌作用主要是影響細胞的生長和增殖。同時，KRAS突變遺傳背景具有異質性, 對于KRAS基因突變治療的藥物研究迫在眉睫。本文就目前針對腫瘤KRAS基因突變的靶向治療的研究進展進行綜述，為KRAS突變腫瘤治療提供最新線索。

1 KRAS基因

RAS是人類基因中重要的原癌基因之一，被認為是控制細胞基本功能的鳥苷三磷酸酶(guanosine triphosphatase，GTPases)大型家族的創始成員，也是表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)信號通路上的重要靶點。其家族基因主要有3種，分別是KRAS、NRAS和HRAS。其中，KRAS基因突變對人類癌癥的影響最為深刻，KRAS基因的突變在人類癌癥中相當常見，占所有人類癌癥的17%～25%[1]。自1982年KRAS作為一種致癌基因首次被發現以來，人們一直在努力開發針對KRAS突變腫瘤的靶向治療。

KRAS基因編碼的產物為一種被稱為P21小G蛋白，具有GTP酶活性，在GTP和GDP結合轉換之間發揮分子開關作用。RAS蛋白結合GDP通過鳥嘌呤核苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factor，GEFs)轉換為GTP，從而使RAS激活[2]。KRAS蛋白控制細胞質信號網絡，并調節多種細胞功能。熱點突變的位置通常發生在第12和13位密碼子上(Fig 1)。突變后的KRAS通過細胞表面受體影響細胞信號轉導，使原本的GTP結合狀態通過喪失內在的催化活性或者是通過GTPase喪失而最終激活蛋白，并啟動復雜信號網絡，持續激活下游RAS-RAF-MEK-MAPK細胞信號通路。此外，KRAS也是其他許多信號通路的關鍵激活因子，導致明顯的生物學效應。例如，磷脂酰肌醇激酶(phosphate-3 kinase，PI3K)和Ral蛋白都是KRAS的下游效應物，在生物學功能上誘導細胞的過度繁殖、浸潤、轉移，以及血管生成和細胞凋亡等一系列腫瘤病理變化，從而促進腫瘤發生[3]。KRAS網絡及其下游通路之間的相互作用的復雜性，使得KRAS基因突變蛋白難以通過傳統手段抑制其活性，同時，KRAS對GDP和GTP酶的固有高親和性以及蛋白質表面缺乏明確的藥物位點[4]，多年來在癌癥基因組領域被稱為“癌基因的珠穆朗瑪峰”。

Fig 1 KRAS hotspot mutation site

目前，大規模的臨床研究發現，KRAS基因點突變在胰腺癌中發生頻率最高，約有90%的胰腺癌患者具有至少1種KRAS基因的點突變；在結直腸癌發生的初始階段，約有34.2%～52.7%的原發性結直腸癌患者中可以檢測到突變型KRAS基因[5]。在非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)的KRAS突變中，KRAS基因的突變率在東方人群和西方人種中具有較大差異，是西方人種最常見的突變基因，突變率接近30%[6]。KRAS突變腫瘤仍然是一種高度未被滿足臨床需要的疾病，三十多年來，對KRAS基因突變藥物研究的步伐從未停滯。研究發現，靶向藥物具有激活免疫反應的作用, 靶向治療結合免疫治療可以有效縮短免疫治療響應周期, 而免疫治療提高了機體內的抗腫瘤免疫反應, 也有利于靶向藥物發揮作用[7]。研究者們主要從KRAS的基因水平、蛋白水平、功能水平的抑制，以及聯合用藥和協同致死等方面，進行多方面的深入研究(Fig 2)。

Fig 2 Targeted strategies for inhibiting KRAS function in different stages

2 KRAS基因突變藥物治療進展

2.1 抑制KRAS轉錄調控下調KRAS表達KRAS的表達受多種微小RNA的直接調控。KRAS已知是miR-200c(一種小RNA抑制劑)的直接靶點，參與細胞外基質(extracellular matrix，ECM)重構的基因調控因子。過表達miR-200c可降低KRAS基因的表達。其下游的磷酸化Akt與ERK通路也發生了相應的下調，膀胱癌細胞的增殖能力也發生了明顯的抑制[8]。Sun等[9]證明，miR-202能靶向非小細胞肺癌中的KRAS，過表達miR-202可以抑制RAS/MAPK通路活性水平，此外，miR-202表達水平的恢復可以提高非小細胞肺癌細胞對順鉑化療的敏感性。

2.2 利用siRNA干擾技術干擾KRAS突變干擾KRAS已經被證明在控制胰腺癌細胞系增殖方面是有效的，目前Khvalevsky等[10]研發了一種傳遞系統LODER，使siRNA(siG12D LODER)能夠干擾抵抗突變的KRAS。對siG12D LODER進行了體外和體內結構、釋放和傳遞特性的評估。在原位小鼠模型中，評估了siG12D LODER對腫瘤生長的影響。進一步評估KRAS沉默對KRAS下游信號通路的影響。研究還發現，LODER包封的siRNA可在體內存活155 d，且穩定活躍。siG12D LODER處理胰腺癌細胞株后，KRAS表達水平明顯下降，抑制了胰腺癌細胞的增殖和上皮間充質的轉化。在體內，siG12D LODER可以抑制胰腺腫瘤細胞的生長。納米顆粒載體作為有效siRNA傳遞的潛在候選載體具有以下優點:① siRNA不容易被降解;② siRNA在腫瘤內局部緩慢釋放，作用持續時間較長;③ siG12D LODER具有治療作用，不會導致任何局部或全身的副作用[11]。

2.3 基于反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide，ASO)的抑制KRAS策略Ross等[12]使用基因療法，描述了AZD4785的臨床前評估，這是一種高親和力約束的含乙基的反義寡核苷酸靶向KRAS mRNA。AZD4785細胞中KRAS的mRNA和蛋白高效地、有選擇地耗盡，導致KRAS突變細胞下游效應通路的抑制和有選擇地抗增殖作用。AZD4785介導的KRAS的缺失與MAPK通路的反饋激活無關，而RAS-MAPK通路則與此相關。全身給予AZD4785可有效地抑制KRAS在腫瘤中的表達和抗腫瘤活性，展示了一種反義寡核苷酸抑制KRAS的療法。研究中使用的反義寡核苷酸經過化學修飾，允許通過皮下注射進行全身輸送，避免使用專門的運載工具。Ross等[12]在多只非小細胞肺癌模型小鼠上測試了這種療法的有效性，并評估了它在靈長類動物中的安全性，證明了它在人類的潛在適用性。

2.4 抑制KRAS基因突變體酶活性水平更多的研究者開始將他們的目光放在針對KRAS基因突變體蛋白靶向的小分子藥物的研究中。如Ostrem等[13]發現了一種KRASG12C突變體特異性抑制劑，該抑制劑能有效抑制KRASG12C突變體和GTP結合，促進其與GDP的結合，阻止了后續下游信號的活化。Lim等[14]報道了另外一種KRASG12C抑制劑，在不影響正常KRAS的情況下，特異性結合突變的KRAS基因，共價抑制劑KRASp.G12C等位基因能夠對突變的KRAS進行直接和特異性的抑制，使突變的KRAS失去活性。最近，一種針對KRASG12C變構開關Ⅱ口袋的新型細胞活性和突變特異性抑制劑，顯示出更強的效率和選擇性，進一步揭示了KRASG12C快速循環其核苷酸底物[15]。KRASG12C選擇性抑制劑的開發開啟了一個里程碑式的發現，它改變了RAS蛋白從不耐藥到耐藥的認知。最近在RAS與RAF和其他效應蛋白的結合中，發現了新的RAS模擬小分子藥物Rigosertib，用于KRAS突變體的腫瘤的治療[16-17]。

2.5 KRAS蛋白降解調節劑LZTR1是一個與人類疾病有關的新型RAS調節劑，關于RAS調節的替代機制將導致人們開發出治療RAS驅動疾病的新型治療方法。M. Steklov等[18]研究發現，內源性人LZTR1與主要RAS同種型結合。LZTR1介導的RAS在K170位點泛素化抑制了RAS-MAPK信號通路。該研究結果為LZTR1參與多種遺傳性和獲得性人類疾病提供了分子基礎，LZTR1介導的RAS在K170上的泛素化調控RAS活性，而RAS活性的失調導致了人類疾病的發生。一項相關研究表明，LZTR1失調也會導致耐藥性。了解這種非傳統的RAS激活機制可能有助于確定哪些患者可能受益于RAS通路抑制劑，并為這些患者提供新的治療方法。

2.6 阻斷KARS下游的信號通路KRAS下游主要包括PI3K信號通路。PI3K是KRAS基因通路下游的一個重要的效應分子之一，PI3K信號通路以PI3K-Akt-mTOR通路為主，參與并調節細胞的增殖、凋亡、分化、葡萄糖轉運等各種細胞過程。近年來，針對PI3K-mTOR雙重靶向抑制劑，如BEZ-235(一種新型咪唑并喹啉衍生物)用于治療晚期乳腺癌和實體瘤，臨床上顯示該藥物治療不僅可以大大降低耐藥性，增強腫瘤細胞對順鉑、吉西他濱、長春新堿等細胞毒性藥物的敏感性，還能維持糖代謝穩定[19]。

2.7 KRAS基因上游信號通路抑制劑KRAS是EGFR的下游效應物。傳統觀點認為，伴有KRAS突變的腫瘤對酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)具有耐藥性，研究發現[20]，由于KRAS基因的突變可以直接啟動EGF通路下游的KRAS途徑,并間接啟動了EGF信號通路中的PI3K途徑，使得第1代酪氨酸激酶抑制劑埃羅替尼和吉非替尼對KRAS突變引起的非小細胞肺癌治療無效。曲米替尼(Tram，GSK1120212)是一種新的MEK抑制劑，通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)級聯可有效抑制RAS信號通路。

2.8 聯合用藥與協同致死采用曲米替尼和EGFR抑制劑組合的協同作用于KRAS突變型肺癌和胰腺癌細胞，這些結果與單獨使用MEK抑制劑曲米替尼后FRS2磷酸化增強密切相關，即抑制FGFR可增強曲米替尼的作用。同時也發現，靶向特定的RTK(如FGFR1)比靶向多效應因子(如AKT29)更容易耐受，并為進一步開發出更具特異性的FGFR1拮抗劑提供理論依據[21]。Dai等[22]發現，Tram治療引起了RAS上游的反饋激活，誘導KRAS突變腫瘤中磷酸化MEK和磷酸化ERK的反彈。這種ERK持續抑制的失敗導致了耐藥性。唑來膦酸(ZA)是一種含氮雙膦酸鹽，通過抑制RAS基因的異戊二烯?；?，破壞RAS基因的生物活性。ZA通過甲戊酸鈉通路增強了Tram的作用，可能代表一種治療KRAS突變型癌癥的新策略，從而克服了耐藥性問題。瑞格非尼是一種口服多激酶抑制劑，其主要靶向抑制Ras/Raf/MEK/ERK通路中的RTKs，通過該聯合用藥可有效阻斷Ras/Raf/MEK/ERK信號通路。對于轉移性結直腸患者，采用瑞格非尼和福爾菲利聯合應用，臨床上取得了良好的療效[23]。

KRAS突變基因的協同致死策略雖具有挑戰性和艱難性，但仍是有希望的治療方案。在26個結直腸癌和胰腺癌模型組中，證實了KRAS突變基因協同細胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependent kinase 1，CDK1)合成致死適用于具有氨基酸位置12(p.G12V、pG12D、p.G12S)或氨基酸位置13(p.G13D)KRAS突變的腫瘤細胞。從機制上講，CDK1抑制導致KRAS突變細胞的S期分數降低，這種作用的特點在于調節Rb，即G1/S檢查點?？傊@些觀察結果表明，KRAS/CDK1相互作用是一種強大的合成致死效應[24]。Sharaf等[25]發現，聯合益生菌和塞來昔布同時使用治療持續18周，結果發現這種組合方法可能降低腫瘤負擔，減少腫瘤的多樣性，降低抗凋亡Bcl-2、原癌基因KRAS的表達，上調促凋亡Bax和抑癌因子p53的表達。

3 總結與展望

總的來說，KRAS靶向治療藥物的一個重要問題是，這些藥物是否需要對KRAS的突變形式進行特異性的抑制，或者非選擇性對KRAS的突變型和野生型的抑制是否具有預期的抗腫瘤活性和必要的安全性，是評價能否成為有價值的靶向抗癌藥的指標。抑制RAS基因的最佳途徑還有待確定，因為這些藥物通過直接靶向RAS蛋白或RAS信號轉導的方式在進入臨床前還有很長的路要走。