Keap1-Nrf2-ARE信號通路及其激活劑的研究進展

姚 娟, 吳平安, 李 蕓, 李越峰, 劉東玲, 劉雪楓

(甘肅中醫藥大學藥學院，甘肅 蘭州 730000)

Kelch樣ECH相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)-核轉錄因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2)-抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)信號通路是一個綜合的氧化還原反應體系，有多個激活途徑維持細胞的氧化還原平衡及代謝，它能調節機體1%～10%的基因[1]。機體內的一些酶和蛋白質，如NAD(P)H:醌氧化還原酶1、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽S-轉移酶、超氧化物歧化酶、血紅素氧合酶-1、過氧化氫酶、硫氧還蛋白還原酶等，都具有解毒和抗氧化防御功能，這些蛋白及酶的表達和轉錄調控都依賴于Nrf2信號通路的激活。Keap1-Nrf2-ARE信號通路與氧化應激相關的多種疾病，包括癌癥、阿爾茨海默病、帕金森病、糖尿病等都有相關性[1]。因此，發現及研究Keap1-Nrf2-ARE信號通路的激活劑，對于預防和治療氧化應激誘導的疾病具有重要意義。

1 Keap1-Nrf2-ARE信號通路的結構

1.1 Keap1Keap1是分子質量為69 ku的蛋白，它是Nrf2的負調節器。人類Keap1的蛋白質序列中包含5個區域，由627個氨基酸組成，如Fig 1所示，包括N端區域(N-terminal region，NTR)、BTB區域(broad complex，Tramtrack，and Bric-a-Brac，BTB)、中間連接區域(linker intervening region，IVR)、Kelch區域以及C端區域(C-terminal region，CTR)[2]。BTB區域附于actin結合蛋白上，負責同源二聚化Cul3與Nrf2泛素化過程。IVR含有半胱氨酸殘基，對氧化和核輸出信號敏感。Kelch區域擁有介導Keap1與Nrf2連接的多個蛋白接觸位點。人類Keap1蛋白共包含27個半胱氨酸殘基(Cys)，其中7個Cys(Cys151、Cys257、Cys273、Cys288、Cys297、Cys434和Cys613)對活性氧(reactive oxygen species, ROS)和親電試劑具有較高的活性，可參與氧化還原信號傳導[2-3]。

Fig 1 Organization of structure domains in Keap1

1.2 Nrf2Nrf2是bZip轉錄因子和CNC轉錄因子家族中的一員，人類Nrf2蛋白含有605個氨基酸殘基，組成從Neh1到Neh6的6個保守結構域，如Fig 2所示[4]。Neh1具有bZip序列，負責與Maf蛋白的異源二聚化，Nrf2-Maf二聚體可以結合在ARE上，誘導基因的表達。在N末端，Neh2區域包含DLG和ETGE序列，可以結合在Keap1的Kelch區域上，負性調控Nrf2的轉錄活性。Neh3區域位于C末端，Neh4和Neh5可以通過結合到組蛋白乙酰轉移酶上，調解Nrf2的反式激活。Neh6對Nrf2具有不依賴于Keap1的負性調控作用[4]。人類Nrf2蛋白上含有6種半胱氨酸殘基，半胱氨酸(Cys183、Cys506)和另外2個關鍵氨基酸殘基(Ser40、Tyr568)也可以通過氧化磷酸化，調控Nrf2的定位和目標基因的轉錄。所以，Nrf2是抗氧化反應的主要調控器[5]。

Fig 2 Organization of structure domains in Nrf2

1.3 AREARE也被稱為親電效應元件，是一種包含特定DNA序列的順式調節元件，位于具有細胞保護作用蛋白質及二相代謝酶基因編碼的上游。在氧化應激條件下，穩態化的Nrf2轉位進入細胞核內，與Maf形成異二聚體，激活ARE依賴的基因表達。Bach1是一個依賴ARE基因的負調節器，它與ARE和Maf蛋白二聚體的形成相關，阻止Nrf2在正常生理條件下與DNA的結合[6]。

2 Keap1-Nrf2-ARE信號通路的小分子激活劑

目前已知的ARE激活劑基本都是Keap1-Nrf2相互作用的間接抑制劑，它們可與Keap1半胱氨酸上的巰基通過氧化或烷基化形成共價加合物。親電性是大多數已知誘導劑的共同特征[7]，但是并非所有的親電試劑都能調控ARE的活性。親電試劑的生物效應取決于其與親核試劑相互作用的速率和選擇性。加合物的形成不僅依賴于親電試劑的性質，還取決于親核中心的蛋白微環境。不同類型的親電試劑可以在Keap1-Nrf2與蛋白質半胱氨酸殘基中顯示不同的反應模式，從而導致不同的生物學效應[8]。親電試劑修飾Keap1的半胱氨酸殘基后，誘導Keap1和Nrf2解離，抑制Nrf2通過泛素化降解，進而促進Nrf2核轉位。

基于與Keap1-Nrf2相互作用的小分子抑制劑的化學結構，以及與半胱氨酸巰基作用的性質，目前公認的可與Keap1-Nrf2相互作用的抑制劑有以下幾類。

2.1 具有氧化性的酚和醌類多酚化合物在作用于Keap1-Nrf2-ARE信號通路前，就可以作為抗氧化劑直接清除自由基。在20世紀70年代，研究發現酚類抗氧化劑BHA可誘導細胞保護酶的表達。結構修飾BHA得到BHT和tBHQ，發現結構變化對ARE誘導活性的影響非常小。邁克爾受體是ARE的誘導基團，因此，可以推測酚類ARE誘導劑可在氧化后形成類似邁克爾受體，能誘導ARE的相應親電性醌類。這一假設得到3個異構體二酚的支持，通過測定兒茶酚(1,2-二酚)、間苯二酚(1,3-二酚)和對苯二酚(1,4-二酚)的氧化電勢和誘導ARE的能力發現，兒茶酚和對苯二酚可誘導ARE的活性，而間苯二酚無活性[9]。在氧和過渡金屬存在情況下，tBHQ被氧化為tBQ，并迅速地與Keap1蛋白進行邁克爾加成反應，激活ARE相關的轉錄。也有人認為，雙酚經過細胞色素P450介導的氧化反應，在體內形成醌，促進了最終的誘導作用[10]。內源對位及鄰位氫醌，如兒茶酚雌激素、多巴胺和L-DOPA也可以誘導ARE依賴的防御反應[10]。

槲皮素存在于許多植物中，是一種來自植物的黃酮類抗氧化劑。槲皮素可以抑制Nrf2的降解，促進Nrf2轉位入核，以增加細胞核內Nrf2的水平。白藜蘆醇是主要存在于紅葡萄皮和其他水果中的二苯乙烯類和非黃酮多酚類化合物，研究發現，白藜蘆醇類似槲皮素，可誘導Nrf2介導ARE基因的表達[11]。綠茶富含兒茶素多酚，其中含量最豐富的是表兒茶素沒食子酸酯(EGCG)，它是綠茶發揮抗氧化作用的主要活性成分。研究表明，EGCG可增加細胞核中Nrf2的水平，也可誘導ARE熒光素酶報告基因轉錄。鼠尾草酚和它的酸衍生物鼠尾草酸，是從迷迭香中得到的兒茶酚型松香烷二萜，它們被用作食品的防腐劑和抗氧化劑，并能提高Nrf2的水平，減少脂質過氧化作用和ROS的生成[12]。相對于鼠尾草酚，鼠尾草酸的保護作用更為明顯，可能是由于其具有較高的溶解性或較低的毒性。黃芩素是中藥黃芩中的主要成分，研究表明，黃芩素能明顯提高Nrf2的轉錄活化[13]。

2.2 邁克爾反應受體分子邁克爾反應受體分子是一類效果較好的ARE通路激活劑，邁克爾反應受體分子被認為是溫和的路易斯酸，誘導效力與它們的邁克爾加成反應性呈正比。邁克爾反應受體分子可以與Keap1上的半胱氨酸硫醇鹽基團反應，進而抑制Nrf2的泛素化，誘導抗氧化和細胞保護酶的表達[14]。邁克爾反應受體分子通常在低濃度下表現為有益的細胞應答，高濃度下不會激活Nrf2信號通路，并有細胞毒性。通常在各種植物中存在許多結構上與邁克爾反應受體分子有關的誘導劑，如姜黃素、肉桂酸衍生物、查耳酮、黃酮、萜類化合物等。

姜黃素是印度咖喱的主要成分，結構上有兩個酚官能團和β-二酮結構，姜黃素能直接清除ROS。姜黃素含有兩個易與半胱氨酸巰基反應的邁克爾受體基團，它能通過修飾Keap1上的半胱氨酸巰基，激活Keap1-Nrf2-ARE信號通路[15]。姜黃素還可間接通過刺激上游激酶途徑，激活ARE系統。使用姜黃素作為預防和治療氧化應激相關疾病的藥物，主要弊端是其代謝和化學性質不穩定，膜通透性差，口服生物利用度極低。

肉桂酸類衍生物咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester，CAPE)是蜜蜂蜂膠中的一種活性成分，它具有抗有絲分裂、抗炎和免疫調節功能。阿魏酸及其衍生物如阿魏酸乙基酯(ferulic acid ethyl este，EFE)，多存在于水果和蔬菜中，對蛋白質和脂質的氧化有較強的保護作用。CAPE和EFE都含有α, β-不飽和酮結構，誘導ARE的能力與姜黃素的效果相當[15]。

查爾酮是一類存在于多種植物中的開鏈黃酮類化合物，結構主鏈由兩個苯環通過3個碳原子的α, β-不飽和羰基連接。查耳酮具有許多生物學性質，如抗增殖、抗炎和抗感染活性。兩個典型的查耳酮化合物索法酮和異甘草素可以通過激活Keap1-Nrf2-ARE途徑，誘導細胞保護蛋白的表達。索法酮是中藥苦參中廣豆根酮的衍生物，異甘草素存在于光果甘草的根中。一些天然存在的香豆素衍生物，如歐前胡素和橙皮油素，都具有經Keap1-Nrf2-ARE信號通路誘導ARE相關酶活性的作用。

黃酮廣泛存在于果蔬及茶等人們日常的飲食中，其在結構上含有α, β-不飽和酮。許多黃酮具有誘導ARE的特性，這些黃酮包括4-溴黃酮和β-萘黃酮，天然異黃酮sappanone A[16]等。

倍半萜烯如異土木香內酯，萜類如紫蘇醛和檸檬醛，都含α, β-不飽和香醛，能誘導Nrf2介導解毒酶的表達。穿心蓮葉中提取的穿心蓮內酯具有通過Keap1-Nrf2-ARE途徑，誘導ARE的作用[17]。

黃腐酚是啤酒花中的特有產物，從生姜中可以分離得到6-脫氫姜二酮，黃腐酚和6-脫氫姜二酮可以通過促進Nrf2核轉位，激活ARE系統，其機制與結構中的α, β-不飽和酮結構密切相關。

2.3 異硫氰酸酯類天然異硫氰酸酯(isothiocyanates，ITCs)以惰性芥子油苷前體形式大量存在于十字花科蔬菜中，如西蘭花和卷心菜。一旦食入，芥子油苷由胃腸道微生物菌群的作用轉化為ITCs。異硫氰酸酯基(-N=C=S)的中心碳原子高度親電，容易與巰基反應，形成二硫代氨基甲酸酯。ITCs與Keap1半胱氨酸殘基中的巰基反應，被認為是破壞Keap1-Nrf2的相互作用和最終誘導ARE基因的機制。異硫氰酸酯類化合物中，天然異硫氰酸酯萊菔硫烷(isothiocyanates sulforaphane，SFN)和苯乙基異硫氰酸酯(phenethyl isothiocyanate，PEITC)的研究最充分[18]。亞砜硫代氨基甲酸酯(sulfoxythiocarbamate，STCA)保留了誘導ARE活性的結構特征。STCA類似物的親電性遠高于萊菔硫烷，異硫氰酸酯與巰基可形成可逆的結合物，而STCA與巰基的反應是不可逆的。

2.4 二硫醚和二烯丙基硫化物二硫醚是一種具有抗癌及細胞保護作用的五元環狀含硫化合物。3H-1,2-二硫-3-硫酮(D3T)是最簡單的二硫醚化合物，可從十字花科蔬菜(如卷心菜、甘藍)中提取得到，它五元環內的二硫鍵可與巰基反應。D3T的異構體1,3-二硫-2-硫酮在高濃度下無上述效果，表明1, 2-二硫化物結構的重要性。烯丙基硫化物是一類在蔥屬蔬菜(如大蒜、洋蔥)中發現的有機硫化合物，具有抑制多種癌細胞生長的作用。一些親脂性硫醚，如二烯丙基硫化物(DAS)、二烯丙基二硫化物(DADS)、二烯丙基三硫化物(DATS)具有上調解毒酶表達的作用，活性強度順序為DATS> DADS> DAS，但是潛在誘導ARE活性的機制還知之甚少[19]。

2.5 鄰二硫醇類鄰二硫醇可在體內轉化成親電性質的二硫鍵。研究表明，1,2-乙二硫醇[1]和2,3-二巰基琥珀酸[16]可以激活Nrf2。另一種二硫醇的變體(R)-硫辛酸或α-硫辛酸幾乎存在于所有的食品中，且在菠菜和花椰菜中的含量略多于其他食物，可通過內源性生成。(R)-硫辛酸是一種分子營養素和抗氧化劑，現已證明，它能通過激活Nrf2誘導各種抗氧化酶的表達[20]。

2.6 三價砷類化合物砷(Ⅲ)對硫醇較高的親和性被認為是急性和慢性砷化合物中毒的起因之一。但研究表明，低劑量的砷可降低癌癥的發病率。砷類化合物，如亞砷酸鈉、三氧化二砷(ATO)和單甲基砷酸(MMA)可調節Keap1-Cul3 E3泛素連接酶復合物，以激活Nrf2。雙砷硫醇標記的熒光素試劑(FLASH-EDT2)和氧化苯砷(PAO)也可激活依賴Keap1的Nrf2[21]。

2.7 含硒化合物硫和硒具有類似的負電性，各種有機硒化合物具有細胞保護活性。蘿卜硫素的硒異位體化合物SFN-isoSe對Nrf2的誘導活性比蘿卜硫素(SFN)更為優異。依布硒啉是一種有效的多功能抗氧化劑和抗炎劑，能調節Keap1-Nrf2介導的解毒酶基因的表達[22]。有機硒化合物3-selena-1-dethiacephem也是Nrf2-ARE的活化劑和ROS的直接清除劑。

2.8 氫過氧化物當機體內生成的自由基和過氧化物超出了生物系統的清除或修復能力時，將會誘發氧化應激。過氧化物的O—O鍵可以很容易破裂并釋放氧自由基，進而與巰基反應，以形成磺酸酯(RSO-)。含量較低的過氧化氫和有機過氧化物，如叔丁基過氧化氫可以通過氧化Keap1的巰基，作為誘導劑，激活依賴Nrf2及ARE的基因[23]。

2.9 多烯類多烯類化合物包含1個或多個序列交替的不飽和單雙碳-碳鍵。由于不飽和程度高，這些化合物較易通過生物轉化為親電子代謝物，可與游離巰基反應。類胡蘿卜素是一類多烯化合物，具有癌癥預防作用，類胡蘿卜素可以激活ARE轉錄系統，并誘導抗氧化和細胞保護酶的表達。番茄紅素是一種主要存在于番茄中的紅色類胡蘿卜素色素，番茄紅素及其潛在的氧化代謝產物10,10’-diapocarotene-10,10’-dial包含邁克爾受體基團，可以共價修飾Keap1，活化Nrf2，并提高ARE介導基因的表達[24]。

2.10 重金屬和金屬配合人類生存需要微量的重金屬，如鐵、鈷、銅和鋅，但過量的重金屬是有危害的，一些重金屬如汞、鎘、金、鉛有劇毒。部分重金屬(如汞、鎘、鋅)可以誘導ARE基因的表達。氯化鎘是一種已知的人體致癌物，它能通過多種機制誘導癌癥，這些機制包括誘導異常的基因表達、抑制DNA損傷修復、誘導氧化應激和抑制細胞凋亡。鎘具有誘導ARE基因表達的能力，這可以看作是一種生物防御機制，以對抗鎘誘導氧化應激的影響[25]。金諾芬(Auranofin)是一個含金的抗風濕藥物，它也可以通過激活Keap1-Nrf2-ARE信號通路，發揮抗炎作用。

3 總結與展望

Keap1-Nrf2-ARE信號通路對抗氧化防御機制非常重要，它可以激活細胞的適應性反應，以應對各種氧化應激損傷。Keap1是Nrf2的負性調節器，Nrf2是ARE系統的主要效應器。通過負調節Keap1蛋白激活ARE系統可以誘導一系列抗氧化基因的表達，這對預防氧化損傷、炎癥和腫瘤的發生非常關鍵。因此，激活Keap1-Nrf2-ARE系統，對開發抗氧化、抗炎和抗癌藥物具有很大價值。在過去的幾十年中，許多Nrf2的激活劑已經被開發，部分已進入臨床試驗階段。而且在體外和體內由遺傳或化學試劑誘導二相代謝酶基因表達增高，都可以起到細胞保護的作用。目前，一些天然及合成的小分子已被認定為ARE系統的誘導劑，如蘿卜硫素、甲基多巴索隆、奧替普拉和依布硒林，這些藥物目前已用于多種病癥的臨床試驗，如乳腺癌、前列腺癌、哮喘、慢性阻塞性肺病、慢性腎臟病、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝病等。大多數已知的Keap1抑制劑具有親電性的共同特征，修飾和改變Keap1上的半胱氨酸巰基，可以活化ARE。Keap1-Nrf2的連接處已經演變為直接活化和可逆誘導ARE的分子靶點，這為尋找及研究Keap1-Nrf2-ARE信號通路的激活劑提供了研究方向。