重慶市無償獻血者血液核酸篩查效果分析

秦偉斐，畢蕾靜，李 維，黃 霞

(重慶市血液中心 400015)

目前，根據我國2015版《血站技術操作規程》中獻血者血液傳染性標志物篩查的規定，在實施核酸檢測(NAT)試劑批簽發之前，乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和人類免疫缺陷病毒(HIV)感染標志物應采用1次核酸檢測和2次酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測，ELISA檢測應采用兩個不同生產廠家的試劑；實施NAT試劑批簽發之后，血清學方法和核酸方法即可各檢測1次。對于ELISA檢測陽性的標本可不再進行NAT，直接視為該項目檢測結果不合格。然而，雖然采用2次ELISA檢測，仍可因“窗口期”、隱匿性感染、基因變異及檢測靈敏度不夠高等因素造成一定程度的漏檢[1-3]。NAT是直接檢測病毒核酸，視為降低血清學窗口期漏檢風險最直接、最可靠的方法[4]。本中心于2011年以科研項目的方式啟動了部分獻血者核酸篩查項目的試點，2013年1月開啟對所有獻血者血液進行NAT和血清學檢測并行的模式。為了評估正式啟動獻血者核酸篩查后的效果，評價其在降低輸血相關感染風險和保障血液安全中的作用，作者對2013-2017年本中心無償獻血者血液篩查結果進行回顧性分析，重點分析核酸篩查的結果，包括對比分析Procleix ULTRIO Assay和Procleix ULTRIO Plus Assay試劑的檢測結果，以評估NAT在重慶獻血者血液篩查中的收益情況，現將結果報道如下。

1 對象與方法

1.1對象 (1)標本來源：本中心2013-2017年共收集無償獻血者標本667 398份，分別采用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝血真空無菌采血管，有分離膠的試管采集8 mL用于NAT和無分離膠的試管采集5 mL用于ELISA檢測，標本處理過程嚴格按照說明書和標準操作規程執行。(2)試劑與儀器：HBsAg檢測(英國索林、北京萬泰)、HCV檢測(美國強生、上海科華、北京萬泰)、HIV-1/2檢測(法國伯樂、上海科華)。NAT試劑：HBV、HCV、HIV(1型)NAT試劑盒及HBV、HCV、HIV-1鑒別探針試劑(西班牙Grifols公司)。全自動樣品處理儀(Xan-Tus)；全自動酶聯免疫分析系統(Microlab FAME24/20)；PROCLEIX TIGRIS 核酸檢測系統(西班牙Grifols)；EXL808酶標儀(美國BIO-TEK)。

1.2方法

1.2.1檢測方法 用于ELISA檢測的5 mL標本經全自動樣品處理儀加樣完成后，分別采用兩個不同廠家的試劑對同一項目在全自動酶聯免疫分析系統上進行檢測，HBsAg、抗-HCV、抗-HIV1/2雙試劑2次ELISA檢測；同時，用于NAT檢測的8 mL標本置于樣品架，在自動生物安全開蓋機內開蓋，采用單人份NAT，基于轉錄介導擴增(TMA)的NAT法在Tigris 全自動核酸分析系統上進行HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA 3項聯檢測分析，對NAT聯檢呈反應性的標本進行進一步鑒別檢測。

1.2.2結果判定 所有檢測結果判定依據嚴格按照試劑說明書及標準操作規程進行。ELISA檢測時，當同一檢測項目兩種試劑檢測結果均吸光度/臨界值(S/CO)≥0.8，則直接認定該標本為反應性；如某一檢測結果S/CO≥0.8，則用同一廠家試劑再次雙孔復試，復試結果若任一孔S/CO≥0.8，則認定為有反應性，否則判為無反應性。NAT檢測時，先用ULTRIO試劑進行HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA檢測，聯檢有反應性的標本，則判為NAT有反應性；再分別進行HBV、HCV和HIV-1鑒別檢測，根據鑒別結果，判為某一項目的NAT有反應性。最后，再根據ELISA檢測結果和NAT結果綜合判斷，NAT與ELISA均無反應性的標本為合格標本；NAT與ELISA均有反應性的標本為陽性標本；NAT無反應性而ELISA有反應性的標本為陽性標本，NAT有反應性而ELISA無反應性的標本也為陽性標本。

1.3統計學處理 數據采用SPSS21.0統計軟件進行分析，計數資料以率表示，二者比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1ELISA與NAT結果呈反應性情況 2013-2017年共667 398份無償獻血者血液標本進行了2次ELISA篩查和NAT聯檢反應性，兩種檢測方法共檢測呈反應性標本10 125份，總的反應性率為1.52%(10 125/667 398)。其中ELISA方法檢測呈反應性標本7 975份，反應性率為1.19%(7 975/667 398)。NAT呈反應性標本5 979例，反應性率為0.90%(5 979/667 398)。不同年份檢測總的反應性率比較差異有統計學意義(P<0.05)，其中2013、2014年檢測總的反應性率分別為2.18%、2.12%；2015年開始采取了一系列改進措施，具有反應性的標本明顯降低，2016年檢測總反應性率僅為0.88%，為5年中的最低值，分別與2013、2014年比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2ELISA與NAT反應性標本分布情況 10 125份反應性標本中NAT與ELISA均有反應性的標本3 829份，占總反應性標本的37.82%(3 829/10 125)，NAT與ELISA均有反應性率為0.57%(3 829/667 398)；NAT無反應性而ELISA有反應性的標本4 146例，占總反應性標本的40.95%(4 146/10 125)，單反應性率為0.62%(4 146/667 398)；NAT有反應性而ELISA無反應性的標本2 150例，占總反應性標本的21.23%(2 150/10 125),單反應性率為0.32%(2 150/667 398)。2016年開始采用新一代高靈敏度的Plus Assay試劑后，NAT+ELISA-明顯增高，2016年和2017年分別與其他年份比較，差異有統計學意義(P<0.05)。ELISA和NAT結果見表2；2013-2017年核酸與ELISA檢測獲得的反應性標本中NAT+ELISA+、NAT-ELISA+、NAT+ELISA-的分布情況，見表3。

表1 不同年份ELISA篩查和NAT聯檢反應性情況

a：P<0.05，與2013、2014年比較

表2 ELISA和NAT結果(份)

表3 NAT與ELISA檢測獲得的反應性標本分布情況

a：P<0.05，與2016、2017年比較

2.3NAT聯檢反應性且ELISA檢測非反應性標本鑒別情況 2 150例單NAT反應性標本，共鑒別檢出反應性標本707份，鑒別率為32.88%(707/2 150)；其中HBV DNA反應性標本696份，HIV RNA反應性標本11份，無HCV RNA標本鑒別檢出。NAT總確認收益率為1.06‰(707/667 398)，其中HBV DNA確認收益率為1.04‰，HIV RNA確認收益率為0.02‰,見表4。

表4 單核酸聯檢反應性標本鑒別情況[份(‰)]

3 討 論

受血者感染輸血傳播病原體風險的大小與獻血人群病原體感染率、獻血者血液篩查方法及試劑敏感性、病原體特性、受血者個體免疫狀態等多種因素有關。獻血者血液篩查是保障血液安全的重要屏障。近幾十年來，隨著血液篩查試劑不斷升級換代，檢測設備更加精密和自動化，檢測流程更加規范，血液安全水平明顯提高。更高靈敏度和特異度的NAT技術在我國獻血者血液篩查中已全面采用，目前尚缺乏對我國NAT應用效果的全面評價。

近年來，本血液中心采用Procleix ULTRIO?System和兩種ELISA試劑同時對獻血者血液標本檢測，5年共檢測血液標本667 398例，總反應性率為1.52%，高于其他地區報道[5]，NAT聯檢反應性率為0.90%，也明顯高于國內其他學者報道[6-7]，可能與不同地區人群的總體感染率有關。唐衛國等[8]曾報告2000-2009年重慶市無償獻血者中，HIV感染率呈逐年上升趨勢，說明重慶地區無償獻血者血液安全保障工作壓力大。本研究結果顯示，近5年來ELISA反應率和NAT聯檢反應率整體呈下降趨勢，可能與近年來本中心在血液安全保障方面采取了一系列改進措施有關，如與加強了獻血者獻血前宣傳教育，幫助獻血者進行不適用獻血的自我排除；采用了更靈敏的獻血前篩查方法；逐步取消了互助獻血者等因素有關。

667 398份檢測樣本中，NAT與ELISA同時呈反應性的標本占總反應性的37.82%，單NAT反應標本占總反應性標本的21.23%，單ELISA反應性標本占總反應性標本的40.95%。單NAT反應標本僅為0.32%，比呂蒙恩等[6]報道的0.44%略低；而ELISA單反應性標本反應性率為0.62%。作者曾經在對2015年獻血者HBV篩查結果分析時發現，ELISA單反應性的HBsAg反應性標本中，兩種ELISA試劑均有反應性的標本確證陽性率為78.7%，單試劑反應性的確證陽性率僅為5.3%[9]，提示ELISA單試劑呈反應性的標本中存在相當比例的假反應性。但是，在阻斷輸血相關傳染性疾病的傳播中，ELISA檢測技術作為國家規定的血液篩查方法發揮著重要作用，尤其是ELISA和NAT兩種方法聯合檢測[10]，互為補充，為進一步縮短“窗口期”發揮重要作用。

本研究NAT的鑒別結果顯示，2 150例單NAT反應性標本，共鑒別檢出反應性標本707份，其中HBV DNA反應性標本696份，HIV RNA反應性標本11份，無HCV RNA標本鑒別檢出。NAT總確認收益率為1.06‰，略高于呂蒙恩等[6]、YANG等[11]的報道結果；其中HBV DNA確認收益率為1.04‰，明顯高于美國和歐洲等地區獻血者的HBV陽性率，這與我國乙型病毒性肝炎(乙肝)流行率較高有關；HIV RNA確認收益率為0.02‰，遠高于林詩雅等[12]報道的30多萬獻血者中鑒別檢出2例HIV；HCV RNA確認收益率為0，與國內大部分地區報道相一致。2017年本中心HBV DNA確認陽性率為1.63‰，明顯高于其他年份，這與近年來本中心采用了新一代具有更高靈敏度的Procleix ULTRIO Plus Assay試劑有關。另外，NAT單反應性標本中鑒別率僅為35.90%，而大部分的標本未被鑒別檢出，這是單人份NAT中常遇到的問題。未被鑒別檢出這部分NAT單反應性標本有可能是多方面原因所致。一方面是與本中心現在采用的NAT方法有關，LINNEN等[13]研究發現TMA技術會導致檢測結果呈假陽性；另一方面可能與標本病毒載量較低，鑒別檢測時可能正好未吸取到病毒核酸而導致核酸鑒別假陰性有關。VERMEULEN等[14]曾報道NAT HBV反應性標本主要為隱匿性HBV感染，其次是窗口期HBV感染。高靈敏度檢測試劑的使用，可以提高鑒別確認率，有利于提高對低病毒拷貝數HBV窗口期及隱匿性乙肝的檢出率。本研究結果顯示，本中心增加NAT應用以來，成功阻止了696份HBV DNA陽性和11份HIV RNA陽性血液發往臨床,有效避免了經輸血傳播該病毒的風險。本中心對其中的4份HIV RNA陽性標本的獻血者進行了追蹤隨訪，確認為“窗口期”感染標本[15]。

綜上所述，在重慶地區獻血者血液篩查策略中增加NAT，可以極大地降低經輸血傳播病原體的殘余風險，從而提高血液的安全性。