B7-H4和Foxp3+Treg在宮頸病變組織中的表達及臨床意義

劉 暢，李 坤，舒麗莎△，張 凡

(河北北方學院附屬第一醫院：1.婦產科；2.病理科，河北張家口 075000)

宮頸癌是女性生殖道惡性腫瘤之一，全球宮頸癌每年死亡病例達26.57萬[1]，中國占全世界死亡病例總數的20.1%[2]。其中，局部晚期宮頸癌是導致腫瘤患者死亡的主要原因。腫瘤的發生、發展與免疫逃逸密切相關。B7同源體4(B7 homolog4,B7-H4)是B7家族的負性共刺激分子，其表達上調能抑制機體免疫應答。在胰腺癌[3]、結直腸癌[4]的研究中發現過表達B7-H4能抑制T細胞活化、增殖，在腫瘤進展中起重要作用。調節性T細胞(regulatory T cell,Treg)是以發揮免疫抑制功能為主的T細胞亞群，廣泛分布于多種惡性腫瘤的間質中，Treg的聚集與腫瘤的不良預后密切相關[5-7]。本文通過檢測B7-H4、叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子3陽性(forkhead/winged helix transcription factor3，Foxp3+)Treg在宮頸病變組織中的表達，并探討二者的臨床意義，旨在為宮頸癌的免疫治療提供新靶點及思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院婦產科2016年10月至2018年5月行宮頸活檢或宮頸手術的石蠟包埋標本。按第四版世界衛生組織(WHO)女性生殖器官腫瘤分類標準[8]，以組織病理學診斷為金標準。對照組患者年齡40～55歲，平均(46.2±3.00)歲。宮頸病變患者年齡40～59歲，平均(48.6±5.90)歲，組間年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。所有患者既往未接受過藥物及放化療治療，排除自身免疫性疾病及其他惡性腫瘤。其中，宮頸癌組織標本50份(宮頸癌組)、宮頸高級別上皮內瘤變(high grade squamous intraepithelial，HISL)組織標本30份(HISL組)、宮頸低級別上皮內瘤變(low grade squamous intraepithelial，LSIL)組織標本30份(LSIL組)。對照組為因子宮良性病變行全子宮切除的病灶旁正常宮頸組織20份。在50份宮頸癌標本中，病理類型均為宮頸磷狀細胞癌。其中，國際婦產科聯盟(FIGO)分期Ⅰ期19例，Ⅱ期31例；高分化22例，中低分化28例；腫瘤大于或等于4 cm的18例，小于4 cm的32例；有淋巴結轉移19例，無淋巴結轉移31例。本研究征得患者知情同意，并經醫院醫學倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1主要試劑與儀器 小鼠抗人Foxp3單克隆抗體(Ab20034)，兔抗人B7-H4抗體(ab5069)抗體均購自英國Abcam公司，抗體稀釋濃度分別為1∶100、1∶150，免疫組織化學SP試劑盒購自北京博奧森公司，二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑購自丹麥Dako公司。CX21光學顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2.2檢測方法 將石蠟包埋組織4 μm連續切片，切片固定于經多聚賴氨酸處理的載玻片上。經二甲苯、梯度乙醇常規脫蠟、脫水，高壓抗原修復[B7-H4使用pH值6.0檸檬酸緩沖液,Foxp3使用pH值9.0乙二胺四乙酸(EDTA)緩沖液]。按照博奧森SP免疫組織化學試劑盒操作說明進行操作，3%過氧化氫(H2O2)室溫孵育 15 min 滅活內源性過氧化物酶的活性，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗。山羊血清室溫封閉 20 min。切片分別滴加一抗，4 ℃ 冰箱過夜孵育 14 h。滴加相應二抗室溫孵育30 min，辣根酶標鏈霉卵白素室溫孵育20 min， DAB室溫顯色，蘇木素復染，分化反藍、脫水、透明、中性樹膠封固。以PBS緩沖液替代一抗作為陰性對照組。

1.2.3結果判定標準 B7-H4陽性表達在腫瘤細胞的細胞質及細胞膜中，顯微鏡下選取5個高倍視野，以細胞的細胞質有黃至棕褐色為B7-H4陽性細胞。按染色強度分級：無染色(0分)、淺黃色(1分)、棕褐色(2分)、褐色(3分)。按陽性細胞所占比例計分：無陽性細胞為0分，<10%為1分，10%～50%為2分，>50%為3分。兩項指標乘積，<4分為低表達，≥4分為高表達。Foxp3+主要表達在淋巴細胞的細胞核中。每個切片顯微鏡下選取5個高倍視野(×200)，以細胞核黃色或棕褐色為Foxp3+Treg，計算5個高倍視野Foxp3+Treg平均值。

2 結 果

2.1B7-H4和Foxp3+Treg在不同宮頸組織中陽性表達水平比較 B7-H4在宮頸癌組、HISL組、LSIL組、對照組宮頸組織的陽性表達率分別為78.00%(39/50)、46.67%(14/30)、26.67%(8/30)、10.00%(2/20)。與對照組比較，宮頸癌組、HISL組中B7-H4陽性率明顯升高，組間比較差異有統計學意義(χ2=27.22、7.41，P<0.01)。B7-H4陽性率在LSIL組與對照組之間比較差異無統計學意義(χ2=2.08，P>0.05)。宮頸癌組B7-H4表達陽性率明顯高于HISL、LISL組，差異有統計學意義(P<0.01)。Foxp3+Treg在正常宮頸組織幾乎不表達，陽性表達主要定位于腫瘤間質的淋巴細胞的細胞核。與對照組比較，宮頸癌組、HISL及LISL組中Foxp3+Treg陽性數明顯升高，各組間比較差異有統計學意義(t=-20.30、-15.93、-2.25，P<0.05)。宮頸癌組Foxp3+Treg陽性數明顯高于HISL及LSIL組，隨著宮頸病變的加重，Foxp3+Treg陽性數明顯增多，差異有統計學意義(t=-8.81、-23.02，P<0.01)。B7-H4和Foxp3+Treg在不同宮頸組織中陽性表達水平比較，見表1。

2.2B7-H4和Foxp3+Treg的表達與宮頸癌臨床病理特征間的關系 在宮頸癌組織中， FIGO分期Ⅱ期B7-H4的表達水平明顯高于FIGO分期Ⅰ期，差異有統計學意義(χ2= 6.202，P<0.05)。B7-H4的表達與腫瘤大小、分化程度及淋巴結轉移無明顯相關性(χ2=3.760、0.005、1.746，P>0.05)。Foxp3+Treg細胞數與腫瘤大小及淋巴轉移密切相關，腫瘤直徑大于或等于4 cm者腫瘤浸潤的Foxp3+Treg數量高于腫瘤直徑小于4 cm者(t=2.084，P<0.05),淋巴結轉移陽性者腫瘤浸潤的Foxp3+Treg數量高于淋巴結轉移陰性者(t=2.277，P<0.05)。Foxp3+Treg數與組織分化程度及FIGO分期無明顯相關性(t=0.348、1.754，P>0.05)，見表2。

2.3宮頸癌組織中B7-H4、Foxp3+Treg表達的相關性 Spearman秩相關分析顯示，在宮頸癌組織中B7-H4與Foxp3+Treg表達呈正相關(r=0.34,P<0.01)。

表1 不同宮頸組織中B7-H4及Foxp3+Treg

a：P<0.01，與宮頸癌組比較；b：P<0.05，與對照組比較

表2 宮頸癌組織中B7-H4及Foxp3+Treg表達與臨床病理特征的關系(n=50)

3 討 論

宮頸癌是發生在子宮頸鱗-柱交界處的惡性腫瘤。隨著生活方式的改變，使宮頸癌的發病呈年輕化。雖然手術及放射、化學藥物等治療，使宮頸癌患者的病死率明顯降低。但對于晚期及復發的宮頸癌仍是臨床治療中的難點。近年，許多免疫療法在某些晚期惡性腫瘤治療中取得重大突破，由此為宮頸癌免疫治療開拓了新的治療方法。

HANAHAN等[9]指出免疫逃逸是腫瘤發展過程中新的表型，是腫瘤發生、轉移的重要原因。從人乳頭瘤病毒(HPV)感染發展到宮頸癌，患者宮頸局部微環境中的免疫功能受到抑制，能夠讓腫瘤細胞避開免疫的生理破壞，尤其是T細胞、B細胞和自然殺傷細胞的破壞作用，從而促進宮頸癌發生、發展及轉移。B7-H4是B7家族的新成員，被認為是免疫應答的負調節因子。B7-H4存在于抗原提呈細胞表面，與T細胞表面受體結合的配體相互作用，通過抑制T細胞增殖及細胞因子產生發揮抗腫瘤免疫作用[10]。LIU等[11]發現宮頸癌組織中B7-H4表達明顯上調，并且高表達的B7-H4與患者不良預后相關，推測B7-H4能作為評估宮頸癌患者臨床預后的潛在生物標記物。CHEN等[12]發現喉癌組織中高表達B7-H4可能與腫瘤復發密切相關，通過阻斷B7-H4信號通路可能成為腫瘤治療靶點。B7-H4能活化相關信號通路促進細胞的侵襲、轉移。HAN等[13]研究發現過表達B7-H4的宮頸癌細胞可通過調控磷酸化-酪氨酸蛋白激酶2/信號轉導和轉錄激活因子3(JAK2/STAT3)信號通路,促進白細胞介素-10(IL-10)和轉化生長因子-β1(TGF-β1)的產生，誘導癌細胞惡性進展。隨著免疫檢查點程序性死亡配體1(PD-L1)的阻斷劑在晚期癌癥治療中取得明顯療效，B7家族逐漸引起關注。深入了解B7-H4在宮頸癌中的表達及功能可能為腫瘤免疫治療提供新的靶點。本研究發現B7-H4在正常宮頸上皮幾乎不表達，在宮頸癌組織中的表達明顯上調。主要陽性定位在癌細胞的細胞膜及細胞質中，陽性率為78.00%(39/50)，明顯高于其他3組。隨著宮頸病變的發展，B7-H4的表達水平逐漸增高，當發展至宮頸癌時，B7-H4表達明顯增強并廣泛分布于癌變細胞中，表明 B7- H4在宮頸癌中能抵抗機體抗腫瘤免疫。因此，推斷B7-H4對判斷病變持續或進展有一定參考價值。FIGO分期對于評估患者預后有重要價值。本研究發現B7-H4的高表達與腫瘤的FIGO分期密切相關，說明隨著腫瘤的進展，B7-H4的局部免疫抑制作用增強，有利于癌細胞增殖及轉移。

腫瘤微環境的Treg是一類發揮負性調節作用的免疫細胞，能通過分泌抑制性細胞因子、干擾細胞代謝、介導靶細胞凋亡等途徑抑制效應性細胞的功能，幫助腫瘤細胞逃避免疫攻擊，促進腫瘤的發生、發展[14]。以往研究表明，Foxp3+Treg能在胰腺癌[5]、結直腸癌[6]、乳腺癌[7]患者外周血及腫瘤間質高表達，并與腫瘤預后不良相關。HUANG等[15]研究發現宮頸癌患者Foxp3+Treg陽性表達率為91.67%，陽性表達于T細胞的細胞核。此外，Foxp3+Treg的表達與腫瘤的大小及FIGO分期相關。本研究發現正常宮頸上皮及LISL組織中Foxp3+Treg微量表達，HSIL及宮頸癌組織中的Foxp3+Treg數明顯增多。Foxp3+Treg主要浸潤在腫瘤的間質部，聚集的Foxp3+Treg能直接抑制T細胞增殖及功能，促進腫瘤免疫逃逸。Treg在LISL局部微環境中抑制作用不明顯，機體內利用強大的免疫系統使病變清除。當發展至HSIL及宮頸癌時，增多的Treg發揮明顯免疫抑制作用，使病變不斷進展。此外，本研究還發現Foxp3+Treg表達與腫瘤大小及淋巴轉移密切相關，推測這可能與CC趨化因子22(CCL22)/CC趨化因子受體4(CCR4)介導的信號通路有關。腫瘤細胞能分泌CCL22，能通過CCR4受體招募Treg到腫瘤微環境，使Treg聚集在腫瘤周圍，抑制效應細胞對腫瘤細胞的殺傷作用[16]。本研究與韓麗萍等[17]研究結果相近，該研究顯示Foxp3+Treg表達隨著宮頸病變的加重而增多，并與宮頸癌的淋巴結轉移密切相關，提示Foxp3+Treg的高表達對宮頸癌患者的預后有一定影響。

此外，本研究還發現宮頸癌組織B7-H4與Foxp3+Treg表達呈正相關(r=0.34,P<0.01)，推測二者在宮頸癌的發展過程中具有協同作用。一方面，B7-H4可能通過增加Foxp3+Treg的數量介導免疫逃逸。同時，浸潤的Foxp3+Treg使局部免疫抑制有利于B7-H4的表達。

綜上所述，宮頸癌組織中B7-H4、Foxp3+Treg表達上調，共同形成免疫抑制的微環境，參與腫瘤生長和轉移。深入探討二者在免疫逃逸中的作用及機制，是今后宮頸癌免疫治療的研究方向。