hADRB3重組腺病毒的構建及經心包注射后hADRB3在CHF大鼠體內的表達

宋衍秋,耿 華,劉 珊,薛向陽,毛用敏,徐美林,秦 勤,3,叢洪良,3

(1.天津市心血管病研究所 300222；2.天津市胸科醫院病理科 300222；3.天津市胸科醫院心內科 300222)

β-腎上腺素受體(β-adrenergic receptors，β-ARs)是交感神經系統的重要成員，1983年TAN等[1]首次發現除了傳統的β1/β2-AR之外，人類還存在另一種β-AR，即β3-AR，β1-AR、β2-AR與β3-AR都屬于G蛋白偶聯受體家族成員，三者氨基酸序列有40%～50%的同源性[2]。人類心房和心室均已發現β3-AR的表達，不同于β1/β2-AR在心臟產生的正性肌力作用，β3-AR激動劑表現為負性肌力作用[3]，提示β3-AR可能在心力衰竭的發生、發展過程中發揮一定的作用。有研究發現，β3-AR激動劑較對照組可以明顯提高胸主動脈縮窄心力衰竭小鼠左心室短軸縮短指數，降低左心室舒張末徑，具有心臟保護作用[4]。β3-AR有望成為治療心力衰竭的新靶點。然而目前β3-AR與β1/β2-AR氨基酸序列激動劑同源性較高，因此其激動劑特異選擇性不高，往往兼具β1/β2-AR激動作用，具有心動過速等不良反應。本研究旨在構建攜帶人β3-AR基因(hADRB3)高滴度純化重組腺病毒Ad-hADRB3，并觀察經心包注射后hADRB3在慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)大鼠體內的表達情況，為進一步研究β3-AR在心力衰竭中的作用及具體機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 清潔級Wistar雄性大鼠20只，8周齡，體質量250～300 g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供。

1.1.2質粒、菌種和細胞系 AdEasy-1缺陷性腺病毒載體系統：穿梭質粒pAdTrack-CMV、骨架質粒pAdEasy-1購自武漢淼靈生物科技有限公司；hADRB3 cDNA購自質粒R&D Systems公司；E.coil DH5α、E.coil BJ5183購自天津心血管病研究所；AD293細胞購自天津心血管病研究所。

1.1.3主要試劑及儀器 限制性內切酶HindⅢ、SalⅠ、BamHⅠ、PacⅠ、PmeⅠ購自美國Thermo公司，Plasmid Midi Kit購自德國Qiagen公司，LipofectamineTMLTX Reagent購自美國Invitrogen公司，達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM)、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，0.25%Trypsin-乙二胺四乙酸(EDTA)、Penicilin-streptomycin購自美國Thermo公司，ViraBindTMAdenovirus Miniprep Kit購自美國Cell Biolabs公司，病毒裂解液[0.10%十二烷基硫酸鈉(SDS)、10 mmol/L Tris-HCl pH 7.4、1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)]、瓊脂糖購自美國Prom ega公司，hADRB3 polyclonal antibody購自美國Abnova公司。Multiporator電穿孔儀、舒適型恒溫混勻器臺、Centrifuge 5415D小型高速離心機、Centrifuge 5417R臺式高速冷凍離心機均購自德國Eppendorf公司，電泳儀購自北京六一生物科技有限公司，倒置熒光顯微鏡購自日本Nikon公司，二氧化碳細胞培養箱購自美國Thermo公司，高速冷凍離心機購自美國Beckman公司。

1.2方法

1.2.1pAdTrack-hADRB3重組質粒的構建與鑒定 HindⅢ、SalⅠ雙酶切hADRB3 cDNA質粒，1%瓊脂糖凝膠平板電泳法檢測雙酶切產物，電洗脫回收hADRB3 cDNA片段。HindⅢ、SalⅠ雙酶切質粒pAdTrack-CMV。電洗脫法回收pAdTrack-CMV HindⅢ、SalⅠ雙酶切線性片段。T4 DNA Ligase連接hADRB3 cDNA片段與pAdTrack-CMV HindⅢ、SalⅠ雙酶切線性片段，連接產物轉化E.coliDH5α感受態細胞，經Kan+LB培養基培養，堿裂解法小量提取重組質粒，HindⅢ、SalⅠ雙酶切鑒定重組質粒。堿性裂解法獲取重組完全正確的pAdTrack-hADRB3重組質粒。

1.2.2pAdEasy-hADRB3重組質粒的構建與鑒定 pAdTrack-hADRB3重組質粒經PemⅠ酶切，電洗脫回收線性片段， pAdTrack-hADRB3 PemI酶切線性片段電轉法轉入含pAdEasy-1的E.coliBJ5183電感受態細胞，轉化產物經Kan+LB固體培養基培養，堿性裂解法提取pAdEasy-hADRB3重組質粒，分別行BamHⅠ、PacⅠ酶切鑒定，并對pAdEasy-hADRB3重組質粒行目的基因序列測定(Invitrogen)。應用Plasmid Midi Kit提取重組正確的pAdEasy-hADRB3重組質粒。

1.2.3重組腺病毒Ad-hADRB3的包裝與擴增

1.2.3.1重組腺病毒Ad-hADRB3的包裝 PacⅠ酶切pAdeasy-hADRB3使其線性化。轉染前1 d，AD293細胞種植于60 mm培養皿。轉染時細胞密度40%左右。5 μg PacⅠ線性化重組質粒pAdeasy-hADRB3片段轉染AD293細胞，常規培養7～10 d，每天觀察細胞生長及細胞中綠色熒光蛋白(GFP)出現的情況。當GFP表達呈“彗星”狀，并出現細胞病變效應(CPE)時，收集細胞于15 mL離心管中，經-80 ℃冷凍、37 ℃融化-渦旋震蕩，反復4次，使細胞裂解。離心12 000 r/min×3 min，病毒上清液分裝至1.50 mL離心管中，-80 ℃保存備用。

1.2.3.2重組腺病毒Ad-hADRB3的擴增 感染前1 d，AD293細胞植于100 mm培養皿，感染時細胞密度80%左右。將200 μL Ad-hADRB3病毒液加至1.5 mL DMEM完全培養液中，常規培養90 min后，加入3.50 mL DMEM完全培養液，常規培養。感染第3天，細胞出現明顯CPE并伴有脫落，收集病毒。重復100 mm培養皿感染3次，第4次在2個75 cm2培養瓶中進行。

1.2.3.3重組腺病毒Ad-hADRB3的純化及滴度測定 應用ViraBindTMAdenovirus Miniprep Kit純化重組腺病毒Ad-hADRB3，嚴格按照試劑盒說明書操作。無菌超凈臺內用病毒裂解液稀釋Ad-hADRB3病毒液，稀釋度為1∶10、1∶25、1∶50，測定病毒稀釋液的OD260，1∶50測定2次，1∶25和1∶10測定1次，取4次測量結果的平均值作為最終結果。病毒滴度(V.P/mL)=OD260×病毒稀釋度×測定稀釋度×1.10×1012。

1.2.4重組腺病毒Ad-hADRB3的功能鑒定

1.2.4.1構建CHF大鼠模型及分組、給藥方法 腹主動脈縮窄法構建CHF大鼠模型，用于后續實驗。CHF成模大鼠10只，將其分為觀察組和對照組，每組5只，觀察組心包注射2.50×1011VP/mL NS重組腺病毒Ad-hADRB3 100 μL，對照組予以心包注射0.90% NaCl 100 μL；給予重組腺病毒Ad-hADRB3第7天后處死兩組動物。

1.2.4.2免疫組織化學(IHC)檢測hADRB3在CHF大鼠多臟器中的表達 兩組大鼠處死后，在心、肝、脾、肺、腎及小腸取材后，經固定、包埋、切片，IHC染色，hADRB3抗體稀釋度為1∶50，二氨基聯苯胺(DAB)法顯色。

2 結 果

2.1重組質粒pAdTrack-hADRB3的鑒定 經HindⅢ、SalⅠ雙酶切后pAdTrack-hADRB3可產生1 285 bp片段。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果，見圖1。

1～10：pAdTrack-hADRB3雙酶切；M：DL Marker

圖1重組質粒pAdTrack-hADRB3 HindⅢ、SalⅠ雙酶切鑒定電泳圖

2.2重組質粒pAdEasy-hADRB3的鑒定

2.2.1BamHⅠ酶切鑒定pAdEasy-hADRB3重組質粒 由于pAdEasy-1質粒含有2個BamHⅠ酶切位點，pAdTrack-CMV和獲得的hADRB3目的基因片段中各含有1個BamHⅠ酶切位點，酶切后可產生3個片段(21.0、11.7、5.2 kb)。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果，見圖2。

1：pAdTrack-CMV BamHⅠ酶切;2：pAdEasy-1 BamHⅠ酶切;3：pAdEasy-hADRB3 BamHⅠ酶切；M：DL Marker

圖2重組質粒pAdEasy-hADRB3 BamHⅠ酶切鑒定電泳圖

2.2.2PacⅠ酶切鑒定pAdEasy-hADRB3重組質粒 穿梭質粒pAdTrack-CMV上有2個PacⅠ酶切位點，骨架質粒pAdEasy-1上有1個PacⅠ酶切位點，同源重組成功經PacⅠ酶切產生了1個較大片段和1個4.5 kb左右片段。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果，見圖3。

1、2：pAdEasy-hADRB3 PacⅠ酶切;3：pAdEasy-1 PacⅠ酶切;4：pAdTrack-CMV PacⅠ酶切;M：DL Marker

圖3重組質粒pAdEasy-hADRB3 PacⅠ酶切鑒定電泳圖

2.2.3測序鑒定 DNA測序證實pAdEasy-hADRB3重組質粒中目的基因hADRB3未出現堿基的突變、錯配等異常，與Homo sapiens adrenoceptor beta 3 (ADRB3),mRNA(NM_000025.2)CDS基因序列完全一致。

2.3重組腺病毒Ad-hADRB3在AD293細胞中的包裝與擴增

2.3.1pAdEasy-hADRB3 PacⅠ酶切線性片段轉染AD293細胞 轉染后第2天倒置熒光顯微鏡下即可見散在GFP；轉染后第7天，GFP呈“彗星”狀改變(圖4A)；轉染后第9天AD293細胞出現明顯的CPE，見圖4B。

A：轉染后第7天(×40)；B：轉染后第9天(×200)

圖4 GFP跟蹤重組腺病毒Ad-hADRB3包裝過程

2.3.2重組腺病毒Ad-hADRB3感染AD293細胞 首次感染后第2天即可見GFP呈散在熒光分布；感染后第3天即出現明顯CPE，細胞呈“葡萄”串狀改變。重復感染時，感染后第2天即可見GFP高強度表達(圖5A)；感染后第3天CPE明顯，大部分細胞脫落，見圖5B。

A：感染后第2天GFP表達；B：感染后第3天細胞形態

圖5重組腺病毒Ad-hADRB3感染AD293細胞(×200)

A:心肌細胞(×200);B：肺血管內皮細胞(×100)；C：肝細胞(×100)；D：脾細胞(×100)；E：腎小球毛細血管內皮細胞(×200)；F：腸黏膜上皮細胞(×200)

圖6 CHF大鼠多臟器hADRB3表達IHC染色

2.3.3重組腺病毒Ad-hADRB3滴度測定 分光光度計測定Ad-hADRB3病毒滴度為5.20 ×1012VP/mL。

2.4重組腺病毒Ad-hADRB3的功能鑒定 經心包注射方式給予重組腺病毒Ad-hADRB3感染CHF大鼠，CHF大鼠心、肺、肝、脾、腎及小腸多器官組織切片IHC染色均檢測出hADRB3的表達。在CHF大鼠的心肌細胞、肺細小支氣管上皮及肺血管內皮細胞、肝細胞、脾細胞、腎小球毛細血管內皮細胞及腸黏膜上皮細胞細胞質內均可見hADRB3陽性顆粒，見圖6。

3 討 論

心力衰竭是各種心臟病的終末階段，是威脅全球性公眾健康的主要原因，不僅病死率高、預后差，其醫療支出已經成為國家和國民巨大的經濟負擔。隨著冠心病、高血壓、糖尿病等疾病發病率的上升，心力衰竭已經成為全球亟待解決的公共衛生問題[5]。傳統藥物治療，雖能有效緩解心力衰竭的癥狀，降低患者住院率，但其5年病死率仍超過50%[6]，仍未達到理想的治療效果。因此，進一步探尋心力衰竭的發病機制及防治措施是當今心血管領域的熱點。β3-AR是β-ARs的1個亞型，屬于G蛋白偶聯受體家族。β3-AR在機體廣泛分布，如白色脂肪組織、棕色脂肪組織、骨骼肌、腸道平滑肌、呼吸系統等，主要參與機體的代謝，介導白色脂肪組織的脂肪分解和棕色脂肪組織的產熱作用及胃腸道活動等[7]。有研究在人類和動物模型中均證實衰竭心臟較非衰竭心臟β3-AR表達升高2～3倍，負性肌力作用持續增強，提示β3-AR可能在心力衰竭的發生、發展過程中發揮一定的作用[8-9]。最新的一項關于β3-AR激動劑對CHF患者作用的臨床試驗結果表明，給藥6個月，米拉貝隆(β3-AR激動劑)較安慰劑對心肌梗死后心力衰竭患者左心室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)無明顯影響，不良事件發生率也相似，但探索性分析顯示對于LVEF<40%的患者米拉貝隆可改善患者LVEF[10-11]。提示β3-AR激動劑可能成為治療心力衰竭的一個新方向，但同樣不能忽視米拉貝隆兼具部分β1/β2-AR激動作用。可見一種高效高選擇性β3-AR激動劑對于探索β3-AR在心力衰竭中的作用及機制至關重要。

將外源性基因轉移到細胞或組織穩定表達，合適的載體是關鍵因素之一，常用的載體有病毒載體和非病毒載體。病毒載體主要包括反轉錄病毒載體、腺病毒相關病毒載體、腺病毒載體等[12]。腺病毒作為傳輸載體具有許多優點：(1)宿主范圍廣，對人致病性低。腺病毒可以感染一系列哺乳動物細胞，因此在大多哺乳動物細胞和組織中均可用來表達重組蛋白。(2)可以感染增殖和非增殖細胞，對于心肌細胞、神經細胞等終末細胞而言，腺病毒載體是最佳的外源性基因表達系統。(3)外源性基因容量大，可插入8 kb外源基因，潛在容量可達30 kb。(4)不整合至宿主細胞基因組，無插入致突變性。(5)不需要輔助病毒，能有效地進行增殖，易于培養和純化，病毒滴度可高達1012pfu/mL，適于進行基因治療[13]。由于hADRB3片段較大，因此本實驗選用腺病毒載體系統，構建Ad-hADRB3。

本研究應用AdEasy-1腺病毒系統采用兩步轉化法[14]構建重組腺病毒。第一步先將pAdEsay-1骨架質粒轉化進入大腸埃希菌BJ5183，制備含有pAdEsay-1骨架質粒的大腸埃希菌BJ5183感受態細菌；第二步，將pAdTrack-CMV-hADRB3 PmeⅠ酶切線性片段電轉化轉入大腸埃希菌BJ5183感受態細菌，進而與其內部的pAdEsay-1骨架質粒進行同源重組。該方法明顯提高了同源重組的成功率，縮短了實驗周期，得到廣泛應用[15]。

目前尚鮮見應用腺病毒載體系統構建攜帶hADRB3基因重組腺病毒相關報道。本研究發現，應用AdEasy-1缺陷性腺病毒載體系統，能夠成功構建重組腺病毒Ad-hADRB3，獲得的純化重組腺病毒Ad-hADRB3經心包注射的方式可以有效感染CHF大鼠，hADRB3可以在CHF大鼠心、肺、肝、脾、腎及小腸多器官組織中表達，證實以腺病毒為載體介導的外源hADRB3基因可在CHF大鼠體內有效表達，可為進一步研究人β3-AR在心力衰竭中的作用及具體機制，提供高效、高選擇特異性的實驗工具。