姜黃素對神經膠質瘤細胞的抑制作用及機制研究

王澤夏，封 燁，劉 菲，余良主，李敏才△，胡美純

(1.湖北科技學院藥學院，湖北咸寧 437100；2.信陽農林學院，河南信陽 464006)

膠質瘤是一種常見的原發性腦腫瘤，包括星形細胞瘤、少突膠質瘤和室管膜瘤。多形性膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)是所有腫瘤中最具侵襲性的實體瘤之一，預后極差。分化不良的GBM具有細胞形態多樣性、核異型性、核分裂活躍，組織學特征表現為壞死、血管增生和血栓形成等形態學特征[1]。目前的治療方式有腫瘤切除、化療、放療及抗血管類靶向藥物治療等；由于GBM的特殊性，尋找新的治療方法或更好的藥物具重要意義。姜黃素[1,7-二(4-羥基-3-甲氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮，Curcumin]是從姜黃屬植物粉末狀根莖中分離得到的一種天然多酚類化合物[2]，這種化合物對人類疾病，如炎癥性疾病和神經退行性疾病具有積極的治療作用[3-4]。有研究表明，姜黃素對肝癌、乳腺癌具有抑制增殖、調節信號通路等多種作用[3]。蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，又稱Akt，參與細胞存活、細胞周期調節和細胞增殖生長等多種生物學作用[5]。Akt受到外部信號刺激時，磷酸化Akt(p-Akt)與許多底物的相互作用體現其調節功能。有文獻報道姜黃素能通過調節Akt促進卵巢癌細胞的凋亡[6]。Akt功能還受到其他因素的拮抗作用，如人第10號染色體缺失磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin nomolog deleted on chromosome ten,PTEN)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)和同源盒結構基因(homeobox gene，HOX)B9的調節[7]。PTEN是抑癌基因，PTEN蛋白可以抑制Akt及其下游激酶的活性，從而抑制腫瘤生長和促進凋亡[8]。姜黃素在GBM中的研究報道較少，本研究探討姜黃素對GBM的增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響，進一步揭示對Akt及相關蛋白的調節機制，以為姜黃素臨床藥理作用提供基礎性數據。

1 材料與方法

1.1材料 人膠質母細胞瘤U251細胞株為研究模型。主要相關試劑：姜黃素購自美國Sigma公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自碧云天生物技術研究所；二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM)高糖培養基購自美國Hyclone公司；胎牛血清(FBS)、青霉素-鏈霉素購自美國Gbico公司；Matrigel膠購自美國Corning公司；Hoechst細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自上海貝博生物科技公司；Akt抗體(C67E7)購自美國CST公司；p-Akt抗體(bsm-33281M)購置北京博奧森生物技術有限公司；PTEN抗體(D3Q6G)購自美國CST公司；GAPDH抗體(sc-32233)購自美國Santa Ctuz公司；Akt抑制劑(Quercetin)購自美國Selleck公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 人膠質母細胞瘤U251細胞培養于5%CO2、37 ℃培養箱內。培養基為高糖DMEM含10% FBS和1%青霉素-鏈霉素，待細胞長滿至90%時進行傳代，取細胞對數期進行實驗。

1.2.2MTT增殖實驗 將U251細胞消化后調整細胞密度至8×104個/mL，按每孔100 μL加至96孔板中并放置培養箱中培養過夜。吸去原培養基，加入DMEM高糖培養基100 μL，設6個姜黃素濃度[0(對照組)、5、10、20、30、40 μmol/L]，每個濃度設5個復孔，放入培養箱使藥物分別作用24、48、72 h。作用時間結束后將細胞板取出，每孔加入20 μL的MTT(5 mg/mL)，放置培養箱4 h后取出。吸去96孔板中的液體，每孔加入DMSO 150 μL，室溫反應15 min后放置酶標儀中，使用490 nm進行吸光度(OD)的測定。細胞存活率=(實驗組OD值-對照組OD值)/對照組OD值，設定對照組存活率為1。

1.2.3細胞劃痕實驗 消化后U251細胞鋪至6孔板內培養，待細胞融合至90%～95%時，使用黃槍頭輕輕地在6孔板底部劃一條線。棄去原培養液，分別加入含0(對照組)、10、20 μmol/L的姜黃素培養液，放置培養箱12 h后，棄去培養液，磷酸鹽緩沖液(PBS)潤洗2次，4%多聚甲醛固定10 min后拍照。細胞遷移率=(初始細胞間隙-實驗組細胞間隙)/(初始細胞間隙-對照組細胞間隙)，設定對照組遷移率為1。

1.2.4細胞黏附實驗 在冰上將Matrigel膠與DMEM培養基按1∶2比例混合后按每孔30 μL加至96孔板相應位置中，放置培養箱內1 h。用10 μmol/L姜黃素濃度預作用24 h后調整細胞密度為1.5×105個/mL，每孔加入100 μL,每組設3個復孔。將96孔板放置培養箱90 min后取出，去培養基PBS潤洗2次，4%多聚甲醛固定10 min，0.1%結晶紫染色5～6 min，PBS洗去多余結晶紫。每組拍照結果進行細胞計數，細胞黏附率=姜黃素組細胞數/對照組細胞數。設定對照組黏附率為1。

1.2.5細胞侵襲實驗 在冰上將Matrigel膠與DMEM按1∶2比例混合后按每孔30 μL加至Transwell小室中，同24孔板一起放置培養箱1 h，取出后將未凝固的Matrigel膠吸走。將事先饑餓24 h的細胞消化后并調整細胞密度為6×105個/mL。設3個姜黃素濃度組[0(對照組)、10、20 μmol/L]，每組做3個平行組。上室加入100 μL細胞和100 μL含相應藥物濃度的DMEM無血清培養基。下室加入相對應藥物濃度的含血清DMEM培養基。放置培養箱培養24 h后，取出棄去培養基，4%多聚甲醛固定10 min，用棉簽輕輕擦去未穿過Matrigel膠的細胞，0.1%結晶紫染色5 min，PBS洗去多余結晶紫，待干燥后拍照。每組拍照結果進行細胞計數。細胞侵襲率=實驗組細胞數/對照組細胞數。設定對照組侵襲率為1。

1.2.6細胞Annexin V-FITC/PI雙染凋亡實驗 將無菌的細胞爬片提前放置在24孔板內，把消化的細胞調整密度至3.5×105個/mL，以每孔500 μL加入至24孔板中過夜。棄除培養基，加入分別含0(對照組)、10、20 μmol/L的姜黃素培養基并放置培養箱培養24 h。取出后棄除培養基，PBS潤洗2遍后加入Hoechst染色液染色5 min；PBS潤洗2次，每孔加入400 μL Annexin V結合液，再加入5 μL Annexin V-FITC染色液和10 μL PI染色液，混勻，避光室溫反應10 min，PBS潤洗2次。取出爬片，將有細胞面的爬片貼于含有抗熒光淬滅劑的載玻片上，將載玻片置于正置熒光顯微鏡上，使用UV激發光拍攝Hoechst染色的細胞(細胞核)；使用Blue激發光拍攝Annexin V染色的細胞(早期凋亡)；使用Green激發光拍攝PI染色細胞(晚期凋亡或壞死)。

1.2.7Western blot實驗 將10 μmol/L姜黃素及20 μmol/L Akt抑制劑(Quercetin)作用24 h的細胞取出置于冰上。配制裂解液工作液[加強型放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、磷酸化蛋白酶抑制劑、Cocktail]。用PBS潤洗細胞2次，吸去多余PBS；加入適量裂解液工作液靜置10 min使其細胞充分裂解，使用細胞刮刀刮下后再靜置5 min；將細胞轉移至離心管中離心(12 000 r/min，4 ℃，15 min)，取上清液，使用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白水平并定量；加入相對應體積的5×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) Loading buffer置于100 ℃水浴鍋中煮沸7 min。按照配方制備凝膠，并再每孔加入等體積樣品，并保證每孔蛋白不低于50 μg；使用80 V電泳至分離膠后改120 V電泳至底部。將預先在甲醛浸泡10 min的聚偏氟乙烯(PVDF)膜按照相應順序放置轉膜夾內進行轉膜(270 mA，70 min)。使用5%脫脂牛奶封閉1 h；將PVDF按條帶大小裁剪后放入對應一抗內4 ℃過夜，TBST潤洗3次，每次10 min；放置對應種屬二抗室溫孵育1 h后TBST潤洗3次，每次10 min后顯影。

2 結 果

2.1姜黃素抑制神經膠質瘤細胞增殖 通過觀察姜黃素對U251細胞增殖的影響，在刺激時間相同的條件下，隨著姜黃素刺激濃度升高，U251細胞增殖活性下調；在姜黃素刺激濃度相同的條件下，作用時間越長，U251細胞增殖活性越下降明顯，見圖1。本研究認為10 μmol/L姜黃素刺激24 h為理想實驗刺激條件。

2.2姜黃素抑制神經膠質瘤細胞遷移 不同濃度的姜黃素刺激后，對U251細胞遷移能力均有明顯的抑制作用。與對照組比較，給藥組的U251細胞遷移能力呈下降趨勢，其中10 μmol/L姜黃素刺激下，細胞遷移能力降低至76.54%；20 μmol/L姜黃素刺激下，細胞遷移能力降至37.61%，與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。各組細胞劃痕圖像，見圖2。

2.3姜黃素減弱神經膠質瘤細胞黏附 與對照組比較，在姜黃素刺激下，U251細胞黏附能力減弱，見圖3AB。姜黃素組黏附的數量為(207.97±15.68)個，明顯低于對照組的(299.12±38.40)個；姜黃素組膠質瘤細胞黏附能力下降至68.60%，見圖3。

a：P<0.05，b：P<0.01，與對照組比較

圖1姜黃素對U251細胞增殖的影響(n=3)

A ：初始劃痕圖像；B：對照組細胞遷移12 h后；C:姜黃素10 μmol/L組細胞遷移12 h后；D:姜素素20 μmol/L組細胞遷移12 h后

圖2各組細胞劃痕圖像(×100)

A ：對照組;B:姜黃素組；C：兩組細胞黏附能力比較；a：P<0.05，與對照組比較

圖3對照組與姜黃素組神經膠質細胞結晶紫染色(×100)及細胞黏附能力比較(n=3)

A:對照組；B:姜黃素10 μmol/L組；C：姜黃素20 μmol/L組；D:各組膠質瘤細胞侵襲能力比較；a：P<0.01，與對照組比較

圖4各組神經膠質細胞結晶紫染色(×100)及細胞侵襲能力比較 (n=3)

圖5 各組細胞熒光顯微鏡下Annexin V-FITC/PI 雙染結果(×100)

1：對照組；2：姜黃素組；3：Akt抑制劑組；4：姜黃素+Akt抑制劑組；a：P<0.05，b：P<0.01，與對照組比較

圖6各組U251細胞中PTEN、Akt、p-Akt蛋白表達水平比較(n=3)

2.4姜黃素下調神經膠質瘤細胞侵襲能力 在不同濃度姜黃素刺激后，U251細胞侵襲能力呈下調趨勢，Transwell實驗結果顯示，10 μmol/L姜黃素組侵襲轉移的細胞數量為(110.43±15.08)個，明顯低于對照組的(165.13±20.07)個；當姜黃素濃度達到20 μmol/L時，侵襲轉移的細胞數量為(65.57±5.36)個，膠質瘤細胞的侵襲能力明顯下調至41.00%，見圖4。

2.5姜黃素促進神經膠質瘤細胞凋亡 隨著姜黃素濃度升高，Annexin V-FITC染色陽性細胞及PI染色陽性細胞均逐漸增加，提示膠質瘤細胞凋亡和死亡數量增多。與對照組(4.29%)比較，姜黃素10、20 μmol/L組U251細胞凋亡率(18.99%、32.17%)明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.01)。各組細胞熒光顯微鏡下Annexin V-FITC/PI雙染結果，見圖5。

2.6姜黃素對膠質瘤細胞Akt和PTEN蛋白表達的影響 與對照組比較，姜黃素組U251細胞Akt蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)，見圖6A、B；與對照組相比，姜黃素組U251細胞p-Akt/Akt表達明顯下調(P<0.05)，見圖6A、C。給予Akt抑制劑(Quercetin)刺激作用后，與對照組比較，U251細胞Akt、p-Akt/Akt明顯下調(P<0.05)，見圖6A、B、C。在姜黃素與Quercetin共同刺激下，與對照組比較，U251細胞Akt、p-Akt/Akt表達呈明顯下調趨勢(P<0.05)，見圖6A、B、C。在姜黃素處理的U251細胞，與對照組比較， PTEN蛋白表達明顯提高(P<0.01)，見圖6D。

3 討 論

腫瘤細胞遷移是腫瘤侵襲性的重要表現之一，腫瘤細胞的黏附能力是腫瘤轉移重要的生物學特征，腫瘤細胞的侵襲性是良惡性腫瘤的重要標志。本研究探討姜黃素對膠質瘤細胞U251作用研究，發現姜黃素對膠質瘤細胞的增殖、遷移、侵襲等方面有明顯性抑制作用，并檢測到p-Akt、PTEN蛋白水平表達變化，揭示姜黃素通過這些相關蛋白調節作用機制影響GBM的生物學行為，膠質瘤作為顱內最常見的原發性腫瘤，病死率極高，其治療顯得特別重要。目前基本治療手段是手術加放療，由于腫瘤浸潤性生長方式、放射性損傷周圍正常腦組織的特點，導致治療效果差。 自從2005年美國食品和藥品管理局(FDA)批準了口服烷基化劑替莫唑胺(TMZ)治療GBM以來，TMZ被認為是GBM的一線化療劑[9]，其分子機制是TMZ誘導DNA烷基化、形成交聯，觸發細胞凋亡。TMZ治療缺點是在腦腫瘤內會產生耐藥性[10]。FDA批準的另一種治療GBM藥物是貝伐單抗，是人源化的抗VEGF-A單克隆抗體。VEGF促進血管生成，可上調VEGF信號轉導通路[11]。貝伐單抗通過抑制膠質瘤血管生成、下調VEGF信號通路起到治療作用。有研究發現貝伐單抗與靜脈血栓栓塞、出血和胃腸穿孔等不良反應有關[12]。大多數抗GBM治療藥物涉及單一靶點的調節[13]，開發新的多靶點、更安全的抗GBM藥物具有重要意義。

中藥成分姜黃素來源廣泛，在中國傳統食物如生姜等食物含量成分很大。二酮類化合物姜黃素具有抗炎、抗氧化、降脂等作用，廣泛應用于慢性疾病治療。臨床研究表明，姜黃素單獨或與其他藥物合用，對癌癥患者具有良好的抗癌效果：姜黃素和紫杉醇協同作用可以抑制乳腺癌細胞的生長[14]；姜黃素能增強順鉑、依托泊苷和喜樹堿對癌細胞的損傷作用[15-16]。說明姜黃素對不同類型腫瘤細胞效應作用存在一定的分子靶點。ZHANG等[17]報道姜黃素制劑能穿過小鼠的血腦屏障，這對姜黃素在治療顱內疾病方面提供了實驗依據，為姜黃素對膠質瘤的治療提供了極大的可能性。

惡性腫瘤細胞屬性是無限的增殖與浸潤性生長，腫瘤細胞凋亡是影響腫瘤生長的重要因素。本研究發現姜黃素可明顯抑制膠質瘤細胞的增殖、遷移、侵襲，具有抗腫瘤作用，證明了姜黃素除能對除實體瘤以外的腫瘤也具有抗腫瘤作用。本研究還表明姜黃素能明顯促進GBM細胞凋亡的作用，也是對姜黃素抑制膠質瘤細胞增殖的解釋之一。

Akt/p-Akt是細胞增殖與信號調節通路的重要分子，Akt是信號傳導途徑中重要的蛋白激酶，p-Akt是Akt激活的主要機制，介導多種生物學效應。姜黃素通過聯合甘草次酸下調PI3K/Akt/PTEN信號通路的活化，從而抑制肝癌細胞生長[18]；姜黃素能通過Akt/PTEN/FOXO4通路誘導p53基因表達缺失的肝癌細胞株Hep3B凋亡[19]。這些研究表明，姜黃素可以通過Akt/PTEN通路有效的抑制惡性腫瘤細胞增殖。本研究中姜黃素對總Akt表達沒有明顯的影響，對p-Akt表達有明顯下調作用；發現姜黃素與Akt抑制劑(Quercetin)有明顯的協同效應。本研究認為姜黃素可通過p-Akt/Akt活性調節GBM增殖、侵襲與遷移。

PTEN是腫瘤組織中的抑癌基因，PTEN蛋白的沉默促進腫瘤發生。PTEN蛋白是具有脂質和蛋白磷酸酯酶活性的雙特異性磷酸酯酶，對腫瘤增殖、遷移有抑制作用。本研究發現姜黃素能上調膠質瘤細胞中PTEN表達，對膠質瘤細胞的發揮抑制作用。LEE等[20]報道PI3K/Akt活性調節誘導PTEN泛素化促進腫瘤形成，在本研究中姜黃素下調了p-Akt活性、抑制PTEN泛素化作用，上調PTEN表達從而抑制膠質瘤的形成。因此本研究解釋了姜黃素通過下調Akt/PTEN通路抑制膠質瘤細胞增殖。

姜黃素對GBM作用可能有更多的分子靶點參與其中，如姜黃素促進膠質瘤細胞凋亡的分子機制需要進一步研究；本研究中姜黃素對GBM作用的實驗數據，需要在動物體內的研究證明，是本課題進一步研究的重點。本研究重要意義是天然藥物姜黃素對GBM治療提供實驗和理論依據，可為能通過血腦屏障的抗GBM新藥研發工作提供資料。