大鼠急性一氧化碳中毒后心臟縫隙連接的重構

王學惠，李慧丹，朱秀英，劉慧兵，張永春△

(新鄉醫學院第一附屬醫院：1.心血管內科；2.急診科，河南衛輝 453100)

急性一氧化碳中毒(acute carbon monoxide poisoning，ACOP)是我國北方冬季最常見的急性中毒性疾病，也是病死率最高的職業中毒[1-2]。在許多國家是家庭事故和自殺的主要原因，主要是由于對心臟和中樞神經系統的損害[3-5]。國內外屢見報道ACOP引起的神經系統損害，而對心臟損害關注不夠。ACOP引起心肌損傷表現為心律失常、心力衰竭等，早期表現以心律失常為主，其確切發病機制不清。而關于ACOP條件下心肌縫隙連接的改變，國內外鮮見報道。本研究采用大鼠為實驗動物，應用腹腔內注射純一氧化碳氣體，制備ACOP動物模型，觀察心肌縫隙連接的改變，擬探討ACOP導致心肌損害的發病機制。

1 材料與方法

1.1材料 動物：健康雄性青年Wistar大鼠40只，3～5月齡，體質量(300±25)g，購于新鄉醫學院實驗動物中心。試劑：小鼠縫隙連接蛋白(connexin，Cx)43多克隆抗體購自美國Zymed，山羊抗小鼠IgG購自北京中山生物公司。二氨基聯苯胺(DAB)試劑盒，兩步免疫組織化學(IHC)檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1動物分組 將40只健康雄性青年Wistar大鼠分為ACOP組和對照組，每組20只。

1.2.2一氧化碳氣體的制備 制備一氧化碳氣體采用甲酸加濃硫酸，濃硫酸用作脫水劑，可得純凈的一氧化碳氣體，將一氧化碳氣體收集在負壓引流袋中備用，于應用前新鮮制備。

1.2.3ACOP動物模型的建立 參照PENNEY[6]報道方法并改進。ACOP組大鼠腹腔內注射一氧化碳氣體170 mL/kg， 對照組大鼠腹腔內注射空氣 170 mL/kg。

1.2.4大鼠心電圖的描記 腹腔注射2 h后，通過腹膜內注射水合氯醛(300 mg/kg)麻醉動物。將大鼠固定在手術臺上，用普通的單通道心電圖機，將輸出肢體導線的4個電極轉換成鱷魚夾。走紙速度為25 mm/s，電壓為10 mv/mm。選擇抗干擾，記錄Ⅱ導聯30 s。

1.2.5測定尾血碳氧血紅蛋白(HbCO)水平 中毒后2 h，通過尾切法采集大鼠的尾血，并通過改進的Rodkey FL微量定量法測量血液HbCO水平。

1.2.6ACOP評價標準 觀察大鼠反應和檢測尾血HbCO的水平來確定中毒程度。重度ACOP大鼠表現為精神萎靡，四肢癱軟，運動少，呼吸急促，有便溺。

1.2.7心肌組織Cx43 IHC染色 取左心室心肌組織，脫水后冰凍切片，厚度7 μm。采用IHC染色方法，操作步驟如下：玻片復溫后磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3 min，0.3% Triton-100室溫孵育10 min， PBS漂洗3次×3 min，再0.3%過氧化氫室溫孵育10 min， PBS漂洗3次×3 min，用5%驢血清室溫封閉1 h，滴加1∶100稀釋的 Cx43多克隆抗體，4 ℃孵育過夜， PBS漂洗3次×min，滴加二抗，室溫孵育30 min， PBS漂洗3次×3 min，應用 DAB溶液顯色，用蒸餾水沖洗，用蘇木精復染，用乙醇梯度脫水，用二甲苯透明，并用中性膠封片。以抗體稀釋液代替一抗作為陰性對照。陽性結果判斷：Cx43表達陽性是深棕色顆粒，蘇木精復染的細胞核是淡藍色的。

1.2.8左心室心肌組織Cx43定量檢測 取約30 mg的心肌組織置于研缽內，用液氮研磨，并加入裂解液，離心后取上清液，應用二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白濃度。加入5×上樣緩沖液后，每孔上樣蛋白50 μg，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS- PAGE)分離后，采用Western blot將蛋白質轉至氯二氟乙烯(PVDF)膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h， 然后分別加入抗 Cx43和 GAPDH的抗體，4 ℃搖床孵育過夜。用 TBST漂洗3次×10 min，洗膜后加入二抗，室溫孵育1 h，用 TBST漂洗3次×10 min，加入電化學發光(ECL)顯色，凝膠成像儀掃描拍照，用 Image J軟件進行條帶灰度分析， 以 Cx43與 GAPDH條帶的比值來評定 Cx43表達水平。

1.2.9透射電鏡觀察心肌超微結構 麻醉后立即開胸取出心臟，將左心室心肌組織切成1 mm3的大小塊狀，快速置于4%戊二醛溶液中固定，固定24 h后，將標本送至西安交通大學電鏡實驗中心進行檢測。先將組織塊沖洗，應用1%鋨酸固定1 h，再梯度丙酮脫水，應用環氧樹脂浸透，然后包埋，聚合，切片，片厚約50 nm。應用醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，日立 H-7650型透射電子顯微鏡下觀察心肌組織的超微結構。

2 結 果

2.1兩組大鼠血液HbCO水平比較 ACOP組大鼠中毒后，5～10 min出現煩躁、撞籠，15～25 min出現活動減少、抽搐和昏迷。嘴唇的黏膜、肢端的皮膚顏色轉為櫻桃紅色，部分大鼠出現角弓反張。 對照組大鼠無上述表現。 2 h后采大鼠尾血檢測HbCO水平，ACOP組為(65.13±4.02)%，對照組為(5.22±0.89)%， 兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2兩組大鼠心電圖比較 ACOP組大鼠出現心率減慢，竇性心動過緩、心房纖顫及S-T段壓低或抬高的改變。心電圖異?？偘l生率為80.00%，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

2.3兩組大鼠心肌組織Cx43 IHC染色比較 對照組光鏡下觀察，Cx43表達陽性的棕色顆粒，呈高度規律性排列、分布密集。在心肌纖維縱切面，棕色顆粒呈簇狀，多數分布在垂直于心肌細胞長軸的端-端連接處，而少數分布于與長軸平行的側-側連接處。ACOP組光鏡下觀察，Cx43表達陽性的棕色顆粒，呈無序、紊亂分布，端-端處棕色顆粒分布減少，側-側處及細胞表面分布增加，見圖2。

a:P<0.05，與對照組比較

圖1兩組大鼠心電圖相關指標比較

A:對照組;B:ACOP組

圖2大鼠心肌組織Cx43 IHC染色(×400)

2.4兩組大鼠左心室心肌組織Cx43水平比較 ACOP組與對照組大鼠總Cx43(T-Cx43)表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；而ACOP組大鼠磷酸化Cx43(P-Cx43)表達明顯降低(P<0.05)，且P-Cx43/T-Cx43兩組比較差異有統計學意義(0.9039vs.0.4905，P<0.05)，見圖3。

a：P<0.05，與對照組比較

圖3兩組大鼠左心室心肌組織Cx43水平比較

2.5兩組大鼠心肌組織超微結構比較 電子顯微鏡觀察顯示，對照組大鼠心肌細胞肌絲排列整齊，結構清晰，肌節規則，線粒體水平豐富，脊呈板層狀橫向排列且致密；閏盤結構清晰，糖原水平豐富。ACOP組大鼠肌原纖維水腫，排列紊亂，電子密度降低，部分肌原纖維溶解，部分肌節斷裂；線粒體腫脹，基質密度淡，線粒體脊排列紊亂；閏盤結構模糊，部分閏盤融合消失，見圖4。

A:對照組;B:ACOP組

圖4兩組大鼠左心室心肌組織的超微結構(×20 000)

3 討 論

一氧化碳中毒對機體的損害主要是缺氧。一氧化碳中毒可引起心肌缺氧，加上一氧化碳對心肌細胞的直接毒性作用，更容易引起心肌損傷[7]。ACOP引起心肌缺血或梗死的機制有[8]：(1)由于一氧化碳和Hb結合形成HbCO，血液的攜氧能力降低，O2-Hb解離曲線向左移，使氧氣不能釋放到組織，導致組織缺氧；(2)一氧化碳和肌紅蛋白結合使心肌線粒體受損，它與線粒體中的細胞色素氧化酶相結合，可抑制細胞呼吸鏈，可以引起細胞呼吸抑制，造成組織進一步缺氧，血管內皮細胞腫脹，血液循環發生障礙，血栓形成，可阻斷冠狀動脈血管，導致心肌梗死。ACOP引起各種心律失常的機制[8]：當ACOP引起心肌細胞急性缺氧時，會導致心肌細胞缺乏能量，局部酸性代謝產物增加，導致細胞膜的離子轉運功能受損，細胞內鉀丟失，而鈉潴留。特殊傳導系統的潛在起搏膜電位降低，去激化速度減慢，自律性增高，而傳導性降低。引起電興奮傳導產生單向阻滯、折返，也可產生異位節律，發生各種心律失常。

ACOP后出現心肌損傷，臨床特征以心電圖異常為主，ACOP后心電圖無特異性改變。常見心電圖異常為T波低平、倒置、S-T段壓低或抬高、Q-T間期延長，可出現早搏、心房顫動、房室和室內傳導阻滯、低電壓等[9-10]。本研究在ACOP組大鼠的心電圖中觀察到心肌受損和多種心律失常，與文獻一致。

縫隙連接主要存在于閏盤處，是心肌細胞間連接的主要方式?？p隙連接使心臟成為功能上的整體，使各部位協調運動。在成年心臟，縫隙連接主要位于細胞兩端閏盤處，由連接蛋白組成的兩個連接子對接而成，而連接子又由6個亞單位-連接蛋白組成[11]。多種心血管疾病的發生、發展與縫隙連接通道功能的受損有關，也與Cx表達改變有關，尤其在心律失常發生中的作用[12]。哺乳類動物心室肌主要表達連接蛋白是Cx43，Cx43屬于磷蛋白，P-Cx43對縫隙連接通道功能有非常重要的影響[13]。

縫隙連接的分布和功能狀態與心肌細胞的傳導方向和速度密切相關。在心房肌，電興奮通過縫隙連接縱向傳導速度較橫向傳導速度快10～20倍，而在心室肌中傳導速度快3倍，與Cx主要分布在心肌細胞兩端特點相一致；利用Cx43基因的定標突變技術發現，雜合子小鼠(Cx43-/+)比野生型小鼠(Cx43+/+)心室肌外膜的電傳導速度下降30%～40%，QRS波的復極時間明顯延長；體外培養的大鼠心肌細胞，隨著細胞縫隙連接增加，細胞間的不規則收縮趨于同步；研究發現，心肌梗死、缺血/再灌注、心肌炎與心肌病等心肌中均出現與心律失常相關Cx43表達的降低與分布紊亂[14]。而UZZAMAN等[15]還發現，這種改變可伴隨縱向傳導速度下降30%。

李玉光等[16]研究發現，Cx43在急性心肌缺血時迅速降解，端-端連接處的降解比側-側連接處明顯，中層心肌細胞間的Cx43比心內膜和心外膜更易降解。Cx43在端-端處分布減少引起心肌細胞縱向傳導的速度明顯下降，傳導各向異性發生明顯改變。這些改變會引起細胞間傳導阻滯和折返，而導致發生心律失常。

本研究IHC染色結果顯示，ACOP組心肌Cx43表達的分布發生了明顯變化。細胞間端-端處Cx43減少，細胞側面及細胞質內分布增加，且由縱軸向橫軸重新分布，分布散亂、無序。與急性缺血時心肌Cx43分布特點相同。急性缺血時心肌的Cx43表達下降，而本文ACOP組大鼠Cx43分布密度不均勻，有些部位稀疏，有些部位密集，可能與ACOP后血管內皮細胞發生腫脹，血循環發生障礙，形成血栓，阻塞冠狀動脈血管，引起心肌梗死，使Cx43在局部心肌降解有關。Cx43表達密度不均，提示Cx43在心肌細胞中各部位分布不均一，會導致心肌細胞間電偶聯不均一性增大，導致興奮傳導速度和擴布路徑發生復雜的變化，會誘導各種心律失常。

研究報道，急性缺血性心肌組織中的P-Cx43水平下降而去磷酸化Cx43(NP-Cx43)水平升高，這使細胞間脫偶聯，導致傳導異常而出現心律失常[17]。YUNIS等[18]在研究擴張型心肌病心律失常機制時認為，P-Cx43水平、分布改變與疾病發生明顯相關。Cx43磷酸化也參與心肌缺血的病理過程。BEARDSLEE等[17]研究發現，正常情況下心肌中的Cx43是磷酸化狀態。當進行缺血預處理時，Cx43出現去磷酸化，而NP-Cx43的比例隨著缺血時間的增加而增加。再灌注時，P-Cx43表達增加，心肌細胞功能逐漸恢復。因此，缺血誘導的解偶聯與Cx43的去磷酸化，縫隙連接內的NP-Cx43的累積及Cx43從縫隙連接向細胞內的轉移相關。

本研究對T-Cx43和P-Cx43水平均進行檢測，發現ACOP時心肌組織的P-Cx43/T-Cx43的比值明顯降低，說明Cx43的磷酸化程度明顯降低，與急性缺血心肌組織表現相似。

趙立明等[19]研究發現一氧化碳中毒后大鼠心肌細胞出現彌漫性心肌細胞線粒體腫脹，線粒體嵴減少，有些嵴溶解消失而變空。而本研究中觀察到ACOP組大鼠心肌的超微結構病理變化類似TRITAPEPE等[20]的報道?？梢娦募〖≡w維水腫，肌節斷裂，糖原顆粒減少。閏盤結構模糊不清，部分閏盤融合消失。與本課題組近期研究的容量超負荷心力衰竭大鼠左心室心肌縫隙連接/Cx43的重構相似：心力衰竭時心肌的縫隙連接受損，連續性中斷，部分縫隙連接溶解消失，電子密度降低；Cx43分布模式發生明顯改變，不是集中于細胞閏盤處，而散在分布在細胞側面和細胞質內；Cx43表達總量明顯下降[21]。閏盤及縫隙連接結構的改變與IHC顯示的Cx43分布變化相符，與文獻[22]報道一致。ACOP組大鼠心肌細胞部分閏盤消失，提示ACOP可導致細胞間連接結構出現改變，導致脫偶聯，且其改變呈非均勻性、非均質性，這種非均質性的縫隙連接改變較均質性明顯增加折返性心律失常發生的可能性。

心臟是ACOP后最易受到損傷的器官，心肌組織中Cx43無序、紊亂分布，在ACOP后發生心律失常的機制中起著非常重要的作用，而心肌細胞和縫隙連接超微結構的變化是其發病的解剖學基礎?？p隙連接/Cx43將成為ACOP后心肌損害的防控靶點。