SU11274逆轉肝細胞生長因子誘導的PC-9肺癌細胞株對吉非替尼耐藥及其機制研究

張 佳，尹海蓮，宋 勉，安昌善

(延邊大學附屬醫院呼吸內科，吉林延吉 133000)

吉非替尼開創了非小細胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)新的靶向治療模式，但因其尚不明確的耐藥機制，致使肺癌的5年生存率仍不容樂觀[1-3]。間質表皮轉化因子(c-mesenchymal-epithelial transition factor,c-Met)被證實是唯一能結合肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)的高親受體， HGF與c-Met結合后，c-Met自體磷酸化，激活細胞內多種信號通路[4-6]，促使腫瘤的進展、侵襲、轉移和血管生成[7]。c-Met抑制劑主要包括小分子抑制劑、抗c-Met抗體、生物性抑制劑、HGF拮抗劑[8-13]。SU11274是一種靶向c-Met小分子的酪氨酸激酶抑制劑，具有抗腫瘤細胞增殖、侵襲和抗血管生成作用。本研究旨在進一步探討 SU11274 在裸鼠體內逆轉 HGF誘導的 PC-9 肺癌細胞株對吉非替尼耐藥及其機制。

1 材料與方法

1.1材料 (1)細胞：PC-9細胞由同濟大學附屬上海市肺科醫院中心實驗室提供；人胚肺成纖維細胞MRC-5由上海生命科學院細胞庫提供。(2)藥物及試劑：吉非替尼原料購自濟南匯豐達化工有限公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)粉購自美國Amresco公司；SU11274(相對分子質量為568.09)購自美國Sigma公司。磷酸化c-Met(p-Met,Tyr1234/1235,145×103)、c-Met(140,170×103)、細胞外信號調節激酶1/2(Erk1/2，42/44×103)、磷酸化Erk1/2(p-Erk1/2，Tyr202/Y204,42/44×103)購自美國CST公司。(3)動物：4周齡、SPF級、雌性BALB/c裸鼠49只，購買于上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號SCXK(滬)2003-0003。食物120 ℃高壓蒸氣滅菌45 min，每日使其維持14 h無光、10 h光照的明暗周期，飲水過氯化為12～15 ppm。

1.2方法

1.2.1細胞培養及藥物配制 將PC-9細胞懸浮液放入含10%胎牛血清達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM)的離心管內，離心、洗滌，棄上清液，加入適當培養基，37 ℃、5%CO2恒溫細胞培養箱中孵育，24 h后更換1次細胞培養液，每2～3天待細胞長滿培養瓶時傳液換代。取SU11274 10 mg，用220 μL二甲基亞砜(DMSO)溶解配制成最終濃度小于0.1%。

1.2.2MTT法檢測HGF、吉非替尼、SU11274單獨或聯合處理后PC-9細胞增殖 取對數生長期的PC-9細胞用胰酶消化后，以5×103個/孔細胞接種在96孔板，細胞貼壁后，加入干預藥物及細胞因子，細胞培養箱中孵育72 h。將20 μL MTT(5 mg/mL)加入每孔內，繼續放進細胞培養箱中孵育4 h。1 200 r/min離心10 min，棄上清液， 200 μL DMSO再加入每孔中，充分混勻約30 min至結晶完全溶解。用酶標儀測量波長530 nm時光密度(OD)值，以上步驟重復進行3次。

1.2.3流式細胞儀檢測HGF、吉非替尼和SU11274單獨或聯合處理后PC-9細胞凋亡 取對數生長期的PC-9細胞按1×105個/孔接種于6孔板，培養24 h。細胞貼壁后棄原培養液，給予相應藥物及細胞因子處理。72 h后，收集全部細胞，1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞1次，再用1×Binding Buffer緩沖液調整細胞濃度為1×106個/mL，取100 μL(1×105個/孔細胞)到新的5 mL試管，各管內加入5 μL異硫氰酸熒光素(FITC)和5 μL碘化丙錠(PI)，輕輕搖勻，室溫(20～25 ℃)、避光15 min。上機前加入1×Binding Buffer緩沖液400 μL，1 h后進行檢測。按以上步驟重復進行3次。

1.2.4Western blot檢測不同濃度的SU11274處理后及HGF、吉非替尼和SU11274單獨或聯合處理后PC-9細胞內c-Met及其下游通道蛋白表達 取5×105個/孔對數生長期的PC-9細胞，給予相應處理后-20 ℃保存。立即冰上裂解細胞，離心收集各組蛋白裂解液。用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量法蛋白定量。取30～40 μg蛋白經8%～10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉印至NC膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗孵育TBST洗膜，二抗室溫搖床孵育再次TBST洗膜，化學發光(ECL)試劑顯色、曝光成像。

1.2.5裸鼠移植瘤模型的建立及藥物抑瘤的分析(SU11274+吉非替尼) 將PC-9細胞和MRC-5細胞消化后，吹打，混勻，使其分別懸浮在DMEM 培養基，制成最終密度PC-9為5×106個/mL、MRC-5為5×106個/mL的細胞懸液。將49只4周齡裸鼠分為7組，每組7只，即對照組(C組)、HGF組(H組)、HGF+SU11274組(HS組)、HGF+0.1% DMSO組(HD組)、吉非替尼組(G組)、HGF+吉非替尼組(HG組)、HGF+吉非替尼+SU11274組(HGS組)。C組和G組每只裸鼠右側肋下皮下接種PC-9細胞懸液100 μL，H組、HS組、HD組、HG組、HGS組每只裸鼠右側肋下皮下接種PC-9+MRC-5細胞懸液混合液100 μL。當腫瘤直徑達到4 mm時，C組、H組、HS組和HD組給予1% Tween-80灌胃，G組、HG組、HGS組接受25 mg·kg-1·d-1的吉非替尼灌胃，同時，HS組、HGS組接受100 μg/d的SU11274瘤內注射，HD組接受100 μL的0.1% DMSO瘤內注射，每周給藥5 d，連續4周。每天測量1次裸鼠的質量，每隔3～4 d用游標卡尺測量腫瘤直徑(L)、短徑(D)，計算腫瘤體積，腫瘤體積(V)=0.5×L×D2，繪制腫瘤生長曲線。末次給藥后斷頸處死裸鼠，剝離腫瘤組織，稱取質量計算抑瘤率。抑瘤率=(對照組瘤體質量-實驗組瘤體質量)/對照組瘤體質量×100%。

1.2.6免疫組織化學(IHC)法檢測SU11274處理后PC-9細胞移植瘤組織中c-Met及其下游通道蛋白表達 將已經剝離的腫瘤組織按常規方法進行固定、包埋，并制成石蠟切片。石蠟切片脫蠟并水化后用PBS洗滌3次×3 min。用3%的過氧化氫PBS溶液孵育切片30 min后PBS溶液洗滌3次×3 min。將石蠟切片用微波法進行抗原修復，5%羊血清室溫孵育30 min后甩去羊血清，加入一抗室溫孵育1 h后4 ℃過夜，孵育二抗后室溫孵育2 h。快速加入二氨基聯苯胺(DAB)，孵育約5 min，PBS溶液洗3次×3 min。蘇木素染色，PBS返藍5 min，脫水，透明，以中性樹膠封片。拍攝所有切片，每組中隨機抽取10張照片，用IPP6.0圖像分析軟件進行定量分析。

2 結 果

2.1MRC-5細胞分泌HGF 酶聯免疫吸附測定(ELISA)法檢測的結果顯示，PC-9細胞培養上清液中未檢測到HGF，而在MRC-5細胞的培養上清液中檢測到HGF水平為(1 262.07±89.78) pg/mL，二者比較差異有統計學意義(P<0.04)。

2.2MRC-5細胞分泌的HGF對NSCLC細胞中c-Met及其下游通道蛋白表達的影響 Western blot檢測結果顯示，PC-9細胞與MRC-5細胞培養上清液混合培養前后，PC-9細胞中的c-Met 及其下游蛋白的表達差異無統計學意義(P>0.05);而其磷酸化的蛋白表達活性明顯增加(P<0.05)。定量檢測也可見與MRC-5細胞培養上清液混合培養后，PC-9細胞中c-Met及其下游蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，而p-Met及其下游蛋白水平明顯增加(P<0.05)，見圖1。

圖1 HGF刺激NSCLC細胞中c-Met及其下游蛋白表達

2.3SU11274作用下吉非替尼對PC-9細胞各組移植瘤生長的抑制作用 PC-9細胞移植瘤的C、H、HS、HD組在治療開始時至第25天，組間腫瘤體積比較差異無統計學意義(P>0.05)。在治療開始第7～25天,G、HG、HGS組移植瘤體積均明顯縮小(P<0.05)，G、HGS組移植瘤體積在第25天為(84.3±15.69) mm3、(66.11±17.79) mm3，而HG組為(201.57±48.52) mm3。各組裸鼠PC-9細胞移植瘤體積不同時期比較，見表1、圖2。

表1 各組裸鼠PC-9細胞移植瘤體積不同時期比較

a：P<0.01,與G組比較;b：P<0.01,與HG組比較;c：P<0.01,與HGS組比較;d：P<0.05,與HG組比較

2.4SU11274對吉非替尼抑制裸鼠PC-9細胞移植瘤質量的影響 第25天時裸鼠處死后稱取瘤質量。在PC-9細胞的移植瘤中，其瘤質量C組為(680±373) mg，H組為(805±492) mg，HS組為(713±258) mg，HD組為(566±364) mg，C、H、HS、HD組裸鼠移植瘤質量組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。G組瘤質量為(29±12) mg，HG組為(66±10) mg，HGS組為(33±17) mg，G組的瘤體質量明顯小于C組和HG組，其差異有統計學意義(P<0.05)；HG組腫瘤質量小于H組，差異有統計學意義(P<0.05)；HGS組腫瘤質量小于HS組及HG組，其差異均有統計學意義(P<0.05)；而HGS組腫瘤質量與G組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。吉非替尼對PC-9細胞G組、HGS組抑瘤率分別為95.80%和95.15%，而對HG組的抑瘤率為90.30%。

a:P<0.05，與G組比較；b:P<0.05，與HG組比較；c:P<0.05，與HGS組比較

2.5SU11274對PC-9細胞移植瘤組織中c-Met及其下游通道蛋白表達的影響 將剝離出的裸鼠移植瘤組織進行IHC檢測發現c-Met和p-Met是位于細胞膜和細胞質的蛋白。與HS、HGS組比較，p-Met在C、H、HD、G、HG組的表達強度明顯升高(P<0.05)；與C、G組比較,H、HD、HG組p-Met的表達強度明顯升高(P<0.05)。Stat3在細胞內位于細胞質，Stat3經磷酸化后進入細胞核。各組Stat3的表達強度比較差異無統計學意義(P>0.05)；而H、HD、HG組中可見p-Stat3的表達強度，與C、HS、G、HGS組比較明顯增高(P<0.05)。Akt和p-Akt均存在于細胞質，各組Akt的表達強度比較，差異無統計學差異(P>0.05)；而p-Akt在H、HD、HG組中的表達強度，明顯高于C、HS、G、HGS組(P<0.05)。Erk1/2在細胞內的定位在細胞質，其經磷酸化后，生成p-Erk1/2進入細胞核，各組Erk1/2表達強度差異無統計學意義(P>0.05)；而p-Erk1/2表達強度在H、D、HG組明顯高于C、HS、G、HGS組(P<0.05)，見圖3、表2。

圖3 各組PC-9細胞移植瘤組織中c-Met及其下游通道蛋白的表達(IHC,×200)

組別p-Metc-Metp-Stat3Stat3p-AktAktp-Erk1/2Erk1/2C組0.167±0.032a0.139±0.022a0.100±0.0420.132±0.0320.157±0.0110.101±0.0240.121±0.0110.113±0.015H組0.225±0.012ab0.150±0.024a0.233±0.025ab0.140±0.0100.225±0.004ab0.102±0.0280.216±0.034ab0.122±0.017HS組0.028±0.0160.053±0.0340.114±0.0510.125±0.0110.146±0.0060.100±0.0440.123±0.0080.130±0.023HD組0.172±0.007ab0.154±0.005a0.244±0.029ab0.122±0.0100.244±0.006ab0.102±0.0370.221±0.038ab0.137±0.024G組0.154±0.018a0.153±0.017a0.096±0.0190.141±0.0300.151±0.0040.098±0.0120.101±0.0080.115±0.005HG組0.218±0.017ab0.147±0.042a0.252±0.022ab0.140±0.0170.228±0.017ab0.110±0.0290.210±0.041ab0.116±0.012HGS組0.026±0.0090.031±0.0160.091±0.0220.129±0.0130.153±0.0090.109±0.0410.108±0.0080.121±0.005

a：P<0.05,與HS、HGS組比較；b：P<0.05,與C、G組比較

3 討 論

在NSCLC的治療中，表皮生長因子受體酪氨酸酶抑制劑(EGFR-TKIs)有著不可替代的重要地位。高水平的HGF通過促進具有c-Met擴增的細胞亞群生長、活化c-Met及下游信號通路及影響T790M突變等方式使EGFR-TKIs產生獲得性耐藥[14-15]。因此針對HGF/c-Met繼發突變的靶向治療，可能逆轉EGFR-TKIs的耐藥。

本實驗中，當用SU11274處理由HGF誘導的PC-9細胞時，被激活的c-Met和其下游的通道蛋白的磷酸化開始受到抑制。而MTT法測定細胞存活率顯示，HGF誘導PC-9細胞后存活率增加，而在用SU11274處理72 h之后恢復到原來水平。檢測細胞凋亡的結果示HGS組與HG組間存在明顯差異，這表明，在c-Met抑制劑SU11274的作用下，吉非替尼對HGF誘導的PC-9細胞的凋亡率都出現顯著提高。免疫印跡結果顯示HGF可明顯刺激c-Met磷酸化及磷酸化的Akt、Stat3、Erk1/2等下游通道蛋白的表達。PC-9細胞中，HGF在吉非替尼作用下仍可刺激c-Met、Akt、Stat3、Erk1/2的磷酸化，SU11274可抑制其表達。綜上表明，c-Met的抑制劑SU11274能夠逆轉由HGF誘導的PC-9肺癌細胞株對吉非替尼的耐藥，其機制可能與抑制HGF活化的c-Met及其下游通道蛋白表達有關。

進一步體內實驗中，將PC-9細胞與MRC-5細胞混合種植于裸鼠右側肋下皮下，部分組再分別以吉非替尼、SU11274處理，檢測腫瘤的體積及質量，吉非替尼能夠抑制PC-9細胞G、HG、HGS組移植瘤的生長，但是對G、HGS組的抑制作用更加明顯。表明吉非替尼能夠抑制PC-9細胞移植瘤的生長(P<0.01)，HGF可抑制其作用，SU11274又可逆轉HGF的抑制作用(P<0.01)。IHC檢測結果顯示PC-9細胞中HS、HGS組p-Met及c-Met表達明顯低于其余各組，而H、HD、HG組中p-Met、p-Stat3、p-Akt、p-Erk1/2表達高于C、HS、G、HGS組。Akt、Stat3、Erk1/2在各組間表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。表明c-Met的抑制劑SU11274能夠逆轉由HGF誘導的PC-9肺癌細胞株對EGFR-TKIs的耐藥，其機制可能與抑制HGF活化的c-Met及其下游通道蛋白表達有關。

EGFR-TKIs在NSCLC的治療中意義重大，因其耐藥的出現限制了其療效及應用，改善這種限制，提高患者的療效是目前最有意義的工作之一。本實驗通過體內、外實驗研究發現經c-Met的抑制劑SU11274處理后，抑制了c-Met及其下游的通道蛋白c-Met、Stat3、Akt、Erk1/2的磷酸化，從而逆轉了HGF誘導的敏感NSCLC細胞株對吉非替尼的耐藥。表明針對HGF/c-Met靶點的治療為NSCLC患者能夠獲得更有效的個體化靶向治療提供了很大的可能性，有望為肺癌患者提供新的生機。