1例馬凡綜合征患者原纖維蛋白1基因突變分析

倪二茹，肖晶晶，吳少鴻，李欣，謝華斌，姜萍萍

(1廈門大學附屬心血管病醫(yī)院，福建廈門361004；2廈門大學醫(yī)學院；3深圳美因醫(yī)學檢驗實驗室)

馬凡綜合征(MFS)是一種常染色體顯性遺傳性結締組織疾病[1]，它的發(fā)生與多種基因的突變密切相關[2]，主要是人原纖維蛋白1基因(FBN1)[3]和轉化生長因子β受體(TGFBR)基因[4]。其中，以FBN1基因突變與馬凡綜合征相關性的研究最多[5]。FBN1基因突變的類型多樣，新的突變位點仍不斷被發(fā)現(xiàn)，目前已報道的FBN1突變超過1 800種[6]。FBN1基因突變的類型和位點與臨床表型有直接的關系，通過基因測序的方法分析FBN1基因的突變情況，有助于馬凡綜合征的分子診斷和家系遺傳分析，同時可以研究FBN1基因突變與臨床表型之間的關系[7, 8]。2018年11月，我們對1例臨床確診馬凡綜合征患者的FBN1基因進行檢測和分析，在分子水平上探討該患者致病的可能原因。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇同期廈門大學附屬心血管病醫(yī)院收治的1例患有馬凡綜合征的先證者及其所有家系成員。先證者男性，18歲，于12歲時體檢發(fā)現(xiàn)心臟雜音，無明顯不適，身高體長且明顯高于同齡人，胸部外凸畸形，CT檢查發(fā)現(xiàn)主動脈根部增寬，心臟超聲提示二尖瓣、三尖瓣脫垂并關閉不全(見圖1)，臨床診斷為馬凡綜合征，未予特殊處理。后患者定期復查，瓣膜反流逐漸加重。14歲時先證者心臟超聲檢查示左心室內(nèi)徑(LVD)63 mm，左心室射血分數(shù)(EF)70%，二尖瓣葉脫垂合并重度關閉不全，三尖瓣葉脫垂合并輕度關閉不全。后先證者于14歲時接受全麻下二尖瓣替換手術，術中探查見二尖瓣瓣葉增厚，鍵索纖細延長，二尖瓣瓣葉脫垂，瓣環(huán)擴張，瓣口對合不嚴。術中進行了雙葉機械瓣間斷縫合，完成二尖瓣置換術。測試瓣膜啟閉良好。術后患者恢復良好，復查未見異常。本研究符合赫爾辛基宣言，并得到了廈門大學附屬心血管病醫(yī)院倫理委員會的批準。先證者及其所有家系成員均簽署了知情同意書。先證者及其所有家系成員的個人信息均得到嚴格的保密。

1.2 家系情況 該先證者家系成員2代共3人，其中患病者1例(即先證者，男性)，見圖2。先證者的父母無馬凡綜合征的臨床癥狀，先證者無兄弟姐妹，父母雙方無相關癥狀的親屬。

1.3 基因組DNA提取 經(jīng)先證者及其所有家系成員同意，取先證者及其父母外周靜脈血4 mL，利用全血基因組提取試劑盒(HiPure Tissue & Blood DNA Kit，美基生物)提取基因組DNA，并測定濃度。

1.4 目標區(qū)域捕獲測序 采用目標區(qū)域捕獲測序技術對先證者進行基因檢測。具體步驟如下：采用Agilent定制化探針試劑盒(瑞士Roche公司)建立含目標基因的全基因文庫，包括已知的13種遺傳性心源性猝死相關疾病的88個基因，其中包括馬凡綜合征相關基因(FBN1、TGFBR1和TGFBR2)。采用Illumina HiSeq2500測序儀(美國Illumina公司)進行高通量測序。

注：左上為CT示主動脈根部寬度為4.46 cm；右上為心臟彩超示三尖瓣反流；左下為心臟彩超示二尖瓣反流；右下為心臟彩超示二尖瓣脫垂。

圖1 先證者心臟超聲表現(xiàn)

注：Ⅰ:1、Ⅰ:2分別為先證者的父母；Ⅱ:1為先證者。

圖2 先證者的家系圖

1.5 生物信息學分析 對上述測序獲得的原始數(shù)據(jù)采用BWA軟件(http://biobwa.sourceforge.net)與hg19人基因組數(shù)據(jù)庫(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/)進行比對，之后使用GATK軟件(https://software.broadinstitute.org/gatk/)進行變異分析，變異位點經(jīng)深圳美因臨床檢驗實驗室自研的軟件進行注釋。變異注釋工作包括：識別單核苷酸變異(SNV)、插入和缺失變異(INDEL)是否引起蛋白質編碼或者是氨基酸改變，識別變異是否在保守區(qū)域；識別變異在人群數(shù)據(jù)庫中的頻率，數(shù)據(jù)庫包括國際千人基因組計劃t(http://browser.1000genomes.org/)、美國國家心肺和血液研究所外顯子組測序計劃(https://evs.gs.washington.edu/EVS/)、外顯子組整合聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(ExAC，http://exac.broadinstitute.org/)和Dbsnp數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)等；計算突變有害性分數(shù)；查找變異與疾病之間的關系，用到的數(shù)據(jù)庫包括HGMD(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)、OMIM(https://omim.org/)、NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和CGD(http://www.candidagenome.org/)。對數(shù)據(jù)庫中的純合變異以及最小等位基因頻率(MAF)大于0.01進行過濾，進一步篩選先證者樣本中的DNA變異。

1.6 位點解讀 數(shù)據(jù)解讀規(guī)則參考美國醫(yī)學遺傳學和基因組學學院(ACMG)相關指南。

1.7 Sanger測序 經(jīng)目標區(qū)域捕獲測序篩選的候選變異位點采用Sanger測序進行驗證，同時在先證者父母中進一步驗證。具體操作步驟如下：聚合酶鏈反應(PCR)，反應條件為94 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s、56 ℃ 45 s、72 ℃ 60 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸5 min；將PCR產(chǎn)物送至賽默飛世爾科技(中國)有限公司進行Sanger測序。

1.8 蛋白結構分析 將突變后的DNA序列進行氨基酸序列預測，之后使用SWISS-MODEL找到與目標序列一致度≥30%的已知結構作為模板。

2 結果

2.1 目標區(qū)域捕獲測序 經(jīng)目標區(qū)域捕獲測序，共產(chǎn)出773.80 Mb數(shù)據(jù)，比對率達99.83%，目標區(qū)域平均測序深度為523.53x，覆蓋度為99.90%。其中FBN1 TGFBR1和TGFBR2基因的測序深度分別達542x、516x、593x，覆蓋度均為100%。共檢測出單核苷酸變異位點(包括錯義突變和同義突變)124個；插入和缺失變異2個。通過對公共數(shù)據(jù)庫過濾，頻率小于0.01的罕見突變有3個。

2.2 生物信息學分析 生物信息學技術分析發(fā)現(xiàn)先證者攜帶FBN1基因c.2023_2026delTTTG突變。轉錄本NM_000138.4，氨基酸變異p.F675Vfs*42，雜合突變，未在千人基因組數(shù)據(jù)庫及EXAC數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)突變頻率。該突變位于17號外顯子區(qū)，屬于移碼突變，導致了675位的苯丙氨酸變成了纈氨酸，并產(chǎn)生新的閱讀框架，終止于第675位密碼子下游42位密碼子處，因此會生成一個縮短并變異的RNA以及蛋白。

2.3 Sanger測序 采用Sanger測序對FBN1基因移碼突變的先證者及其父母進行驗證，結果顯示，先證者為FBN1(c.2023_2026delTTTG,p.F675Vfs*42)的雜合移碼突變，與目標區(qū)域捕獲測序發(fā)現(xiàn)的FBN1基因突變一致，而其父母不具有該突變，因此該突變?yōu)樾律蛔?denovo突變)。見圖3。

2.4 蛋白結構分析 建立FBN1基因p.F675Vfs*42突變翻譯的異常蛋白3D構象后，顯示移碼突變導致了675位的苯丙氨酸變成了纈氨酸，并產(chǎn)生新的閱讀框架，終止于第675位密碼子下游42位密碼子處。FBN1編碼的正常的FBN1前體由2871個氨基酸組成，而p.F675Vfs*42突變編碼的只有716個氨基酸，缺失了大部分的原FBN1正常結構，徹底改變了蛋白質的構象，損壞了蛋白質的功能，不能轉化成正常的FBN1。

注：A為患者Sanger測序結果，存在c.2023_2026delTTTG突變，雜合缺失；B為患者父親Sanger測序結果，無突變；C為患者母親Sanger測序結果，無突變。

圖3 先證者及其父母FBN1基因的Sanger測序峰圖

3 討論

馬凡綜合征是一種常染色體顯性遺傳的疾病，常表現(xiàn)為蜘蛛指(趾)病、細長肢體病、長肢病、指(趾)過長綜合征、長瘦、抑郁癥、蜘蛛手合并晶狀體脫位等[1]。在遺傳學上，馬凡綜合征具有外顯率高、表現(xiàn)度不一等特點，故臨床表現(xiàn)多種多樣[9, 10]，主要變現(xiàn)為骨損壞、眼損害及心血管病變?nèi)?lián)征。該病屬于結締組織遺傳缺陷疾病，其病變可累及全身各個系統(tǒng)，而嚴重的心血管并發(fā)癥是患者的主要致死因素[11]。根據(jù)修訂版Ghent診斷方案[12]，若患者無馬凡綜合征家族史，但主動脈根部直徑Z值≥2，合并晶狀體脫位、FBN1基因突變，系統(tǒng)評分>7分，三者之一；或晶狀體脫位合并FBN1基因突變并主動脈病變，馬凡綜合征診斷成立。本文先證者臨床癥狀表現(xiàn)胸廓畸形、臂展和身高均過大，心臟彩超檢查示主動脈根部增寬，二尖瓣、三尖瓣脫垂并關閉不全，具有典型的馬凡綜合征的臨床表現(xiàn)。

FBN基因家族和TGFBR基因家族是馬凡綜合征的主要致病原因。FBN基因家族中FBN1基因編碼的人FBN1位于15號染色體的長臂(15q15～q21.1)，包含65個外顯子，將近10 000個核苷酸，編碼的蛋白質相對分子量約為350 kDa。該蛋白含有47個表皮生長因子樣結構域，7個8-半胱氨酸結構域，2個雜交結構域和1個富脯氨基酸結構域。FBN1蛋白與其他細胞外基質形成彈性纖維，維持組織的彈性。本文在對先證者的基因組DNA進行目標區(qū)域捕獲測序后，分析了馬凡綜合征相關的FBN1、TGFBR1和TGFBR2基因的突變情況。經(jīng)過生物信息學技術的分析，發(fā)現(xiàn)先證者攜帶了FBN1基因c.2023_2026delTTTG突變。該突變位于17號外顯子區(qū)，由于移碼突變，導致了675位的苯丙氨酸變成了纈氨酸，并產(chǎn)生新的閱讀框架，終止于第675位密碼子下游42位密碼子處，因此會生成一個縮短并變異的RNA以及蛋白。進一步的蛋白結構分析發(fā)現(xiàn)正常FBN1基因編碼的FBN1蛋白有2 871個氨基酸，而FBN1基因c.2023_2026delTTTG突變編碼的FBN1蛋白只有716個氨基酸，缺失了大部分的FBN1蛋白的正常結構，徹底改變了蛋白質的構象，損壞了蛋白質的功能，不能轉化成正常的FBN1蛋白。根據(jù)ACMG評估指南，定義該位點為疑似致病突變的變異，而GeneDx基因檢測公司認為該位點為致病突變。Howarth等[13]在2007年首次報道了該突變，其在兩個非親屬關系的馬凡綜合征的患者中檢測到了該突變；并且在家系驗證中，10個未患病人員未檢測到該突變，而在5例患病人員中均檢測到了該突變；且未在各大數(shù)據(jù)庫中報道。除此之外，F(xiàn)BN1基因c.2023_2026delTTTG突變尚未在其他文獻中報道過。

本文的先證者父母沒有攜帶相同的突變，而先證者沒有兄弟姐妹，故無法對該基因型與臨床表型的關系進行驗證。雖然沒有該位點與馬凡綜合征的表型關聯(lián)的文獻研究報道，但是在與馬凡綜合征相關的FBN1基因突變中，提早終止密碼突變(PTC)以及移碼突變是FBN1突變中的最主要的兩種類型[14]，PTC突變與嚴重的骨骼和皮膚表型相關[15]，很少出現(xiàn)眼部的病變。

綜上所述，本文通過對1例臨床確診馬凡綜合征的先證者及其父母進行FBN1基因的檢測，發(fā)現(xiàn)先證者攜帶的FBN1基因c.2023_2026delTTTG突變會產(chǎn)生一個截短的FBN1蛋白，可能是馬凡綜合征的一個致病突變。