阿福豆苷對結(jié)直腸癌小鼠腫瘤抑制作用及其抗血管生成的影響

邢通潮，祝普利，尹超，馬師洋，高鑫原

(1陜西省第四人民醫(yī)院，西安710000；2西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院；3西安市中醫(yī)醫(yī)院)

結(jié)直腸癌是臨床病死率最高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)病率高居全部惡性腫瘤的第4位，對廣大患者的生命健康造成嚴(yán)重威脅[1～4]。大量研究結(jié)果證實，中醫(yī)藥治療結(jié)直腸癌等惡性腫瘤具有較好的效果，提取自中藥、具有較強(qiáng)抗腫瘤活性的天然產(chǎn)物更是抗癌藥物研發(fā)的主要來源之一[5～7]。香睡蓮是一種經(jīng)典的中草藥，具有較好的防癌抗癌、清熱解毒、祛痰止咳及活血散瘀之功能，而其中糖苷類化合物是該中藥的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。阿福豆苷是提取自香睡蓮水提取物的糖苷類化合物，具有較好的抗胰腺癌、抗菌及血管保護(hù)等活性。盡管近年來國內(nèi)外對阿福豆苷的抗胰腺癌活性進(jìn)行了一定的探討，但研究均主要集中在體外研究，對其體內(nèi)抗腫瘤活性并未進(jìn)行闡述，且對其他類型惡性腫瘤的治療作用亦未進(jìn)行探討。2017年3月～2018年12月，本研究采用BALA/c小鼠作為模型，探討阿福豆苷對結(jié)直腸癌小鼠的治療作用，并對其抗血管生成作用進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 BABL /c小鼠60只，體質(zhì)量(21±2)g，雌雄各半，均購買自陜西省疾病預(yù)防控制中心。阿福豆苷購自美國Sigma公司(批號09092125)；人結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞由中國科學(xué)院昆明動物研究所季維智院士課題組惠贈，初次傳代時間2018年2月；順鉑購自美國Sigma公司(批號09112983)；血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR-2)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)均購自美國Conning公司(批號分別為11092011、20198313、89910324及89102821)；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶、RPMI-1640培養(yǎng)基及10%標(biāo)準(zhǔn)小牛血清均購自上海安博廣利生物科技有限公司(批號分別為0010921、09201921及20910921)。

1.2 分組方法 將60只BABL /c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，飼養(yǎng)條件為標(biāo)準(zhǔn)飼料、55%濕度、晝夜各半及室溫。隨機(jī)分為順鉑組、模型組、高劑量阿福豆苷組、中劑量阿福豆苷組及低劑量阿福豆苷組，每組各12只。

1.3 結(jié)直腸癌模型建立及干預(yù)方法 按照文獻(xiàn)[8]方法，在RPMI-1640全培養(yǎng)基中對結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞進(jìn)行傳代與培養(yǎng)，取細(xì)胞計數(shù)2×106/mL時的對數(shù)期結(jié)直腸癌細(xì)胞，按照0.2 mL/只的接種劑量將其接種于各組小鼠右前肢腋部皮下，接種后1周，檢測各組小鼠右前肢腋部皮下腫瘤直徑，將直徑>10 mm時視為造模成功。順鉑組、模型組、高劑量阿福豆苷組、中劑量阿福豆苷組及低劑量阿福豆苷組分別成功造模11、10、11、11及10只。采用灌胃給藥法對高劑量阿福豆苷組、中劑量阿福豆苷組及低劑量阿福豆苷組小鼠進(jìn)行灌胃給藥，給藥劑量分別為阿福豆苷100、50、25 mg/kg；順鉑組給予順鉑15 mg/kg灌胃；模型組給予等量生理鹽水灌胃。各組均灌胃1次/d，連續(xù)給藥30 d。

1.4 各組小鼠腫瘤體積、重量及腫瘤抑制率檢測 末次灌胃24 h后，采用脫頸法將各組小鼠處死，解剖并取其右前肢腋部皮下腫瘤組織，稱取腫瘤組織重量。采用游標(biāo)卡尺檢測其長短徑，計算腫瘤抑制率及腫瘤組織體積。腫瘤抑制率=(模型組小鼠腫瘤體積-其他組小鼠腫瘤體積)/模型組小鼠腫瘤體積×100%；腫瘤組織體積=(腫瘤組織長徑×腫瘤組織短徑2)/2。

1.5 各組小鼠腫瘤組織病理學(xué)觀察 取各組腫瘤組織，用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片，采用HE染色法對各組腫瘤組織病理學(xué)情況進(jìn)行觀察，主要觀測小鼠腫瘤細(xì)胞的凋亡情況，每個樣本均取10個不同的視野。

1.6 各組小鼠血管生成相關(guān)蛋白表達(dá)檢測 采用熒光免疫法。取各組腫瘤組織，依次進(jìn)行抗原修復(fù)、一抗結(jié)合、二抗結(jié)合、復(fù)染及封片處理，采用熒光免疫法檢測各組小鼠血管生成相關(guān)蛋白表達(dá)情況，主要觀測指標(biāo)為血管生成相關(guān)蛋白：金屬肽酶含血小板反應(yīng)蛋白1(ADAMTS1)、VEGF及HIF-1α，上述蛋白陽性表達(dá)均為橙紅色。采用JA-3型顯微照相系統(tǒng)進(jìn)行拍照，采用Image-proplus6.0軟件分析上述蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠腫瘤體積、重量及腫瘤抑制率比較 與模型組比較，順鉑組、高劑量阿福豆苷組、中劑量阿福豆苷組和低劑量阿福豆苷組腫瘤組織重量及腫瘤組織體積均降低(P均<0.05)。與順鉑組比較，高劑量阿福豆苷組、中劑量阿福豆苷組和低劑量阿福豆苷組腫瘤組織重量及腫瘤組織體積均增高，而腫瘤抑制率均降低(P均<0.05)。與低劑量組比較，高劑量阿福豆苷組、中劑量阿福豆苷組和低劑量阿福豆苷組腫瘤組織重量及腫瘤組織體積均降低(P均<0.05)，而腫瘤抑制率則均增高(P均<0.05)。高劑量阿福豆苷組與中劑量阿福豆苷組腫瘤體積、重量及腫瘤抑制率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠腫瘤重量、體積及腫瘤抑瘤率比較

注：與模型組比較，*P<0.05；與順鉑組比較，△P<0.05；與低劑量阿福豆苷組比較，﹟P<0.05。

2.2 各組小鼠腫瘤組織病理學(xué)比較 順鉑組腫瘤組織中癌細(xì)胞出現(xiàn)大面積凋亡及壞死，模型組腫瘤組織中癌細(xì)胞形態(tài)及染色情況均正常，癌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。高劑量阿福豆苷組、中劑量阿福豆苷組和低劑量阿福豆苷組腫瘤組織癌細(xì)胞亦出現(xiàn)大面積凋亡，但程度均輕于順鉑組。見圖1。

注：A～E分別為順鉑組、模型組、高劑量阿福豆苷組、中劑量阿福豆苷組和低劑量阿福豆苷組。

圖1各組小鼠腫瘤組織病理學(xué)比較(HE染色法，×100)

2.3 各組小鼠腫瘤組織血管生成相關(guān)蛋白表達(dá)比較 熒光染色結(jié)果顯示，模型組腫瘤組織各血管生成相關(guān)蛋白VEGFR-2、VEGF及HIF-1α均呈強(qiáng)陽性表達(dá)，而順鉑組腫瘤組織中上述蛋白僅偶見表達(dá)，高劑量阿福豆苷組、中劑量阿福豆苷組和低劑量阿福豆苷組腫瘤組織中上述蛋白均呈不同程度的陽性表達(dá)，但陽性表達(dá)量明顯少于模型組，見圖2～4。

半定量分析結(jié)果表明，與模型組比較，順鉑組、高劑量阿福豆苷組、中劑量阿福豆苷組和低劑量阿福豆苷組腫瘤組織VEGFR-2、VEGF及HIF-1α相對表達(dá)量均降低(P均<0.05)。與順鉑組比較，高劑量阿福豆苷組、中劑量阿福豆苷組和低劑量阿福豆苷組腫瘤組織VEGFR-2、VEGF及HIF-1α相對表達(dá)量均增高(P均<0.05)。與低劑量組比較，高劑量阿福豆苷組、中劑量阿福豆苷組和低劑量阿福豆苷組腫瘤組織上述蛋白相對表達(dá)量均降低(P均<0.05)。高劑量阿福豆苷組與中劑量阿福豆苷組上述蛋白相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

注：A～E分別為順鉑組、模型組、高劑量阿福豆苷組、中劑量阿福豆苷組和低劑量阿福豆苷組。

圖2各組小鼠腫瘤組織中VEGFR-2的表達(dá)情況(免疫熒光染色法，×400)

注：A～E分別為順鉑組、模型組、高劑量阿福豆苷組、中劑量阿福豆苷組和低劑量阿福豆苷組。

圖3各組小鼠腫瘤組織中VEGF的表達(dá)情況(免疫熒光染色法，×400)

注：A～E分別為順鉑組、模型組、高劑量阿福豆苷組、中劑量阿福豆苷組和低劑量阿福豆苷組。

圖4 各組小鼠腫瘤組織中HIF-1α的表達(dá)情況(免疫熒光染色法，×400)

注：與模型組比較，*P<0.05；與順鉑組比較，△P<0.05；與低劑量阿福豆苷組比較，﹟P<0.05。

3 討論

結(jié)直腸癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤之一，約占全部胃腸道癌癥的第2位，由于其早期癥狀不明顯，患者多無明顯異常改變，或僅伴有輕微腹瀉等不典型癥狀，故超過65%的患者就診時已處于晚期階段，無法接受手術(shù)治療[1,3]。藥物治療是結(jié)直腸癌等惡性腫瘤的主要治療方法，但目前臨床常用的順鉑、卡鉑及5-氟尿嘧啶等藥物均存在部分患者效果不顯著、長期使用可導(dǎo)致耐藥性及部分藥物毒副作用較大等不足，故尋找對結(jié)直腸癌具有顯著療效的新型治療藥物迫在眉睫[9～13]。隨著現(xiàn)代天然藥物化學(xué)的迅猛發(fā)展，天然產(chǎn)物用于惡性腫瘤的治療越發(fā)受到重視，諸多來源于中藥及天然藥物的單體化合物在結(jié)直腸癌等惡性腫瘤治療中的應(yīng)用越來越廣泛[14,15]。

阿福豆苷是一種提取自香睡蓮中的黃酮醇糖苷，早期研究結(jié)果顯示該化合物具有較強(qiáng)的抗炎、抗氧化應(yīng)激、保護(hù)心血管及抗瘧原蟲等活性[16,17]。最新研究表明，阿福豆苷單體化合物對于前列腺癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用，其主要機(jī)制在于阿福豆苷可有效促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的凋亡，抑制癌細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架維護(hù)過程中相關(guān)激酶的表達(dá)[17]。此外，阿福豆苷在體外還可有效抑制血管生成相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而抑制癌細(xì)胞在體外的浸潤能力，降低其轉(zhuǎn)移性[16]。盡管國內(nèi)外對于阿福豆苷的抗前列腺癌活性進(jìn)行了一定的探討，但上述研究均主要闡述了該化合物的體外抗腫瘤活性，但對于該化合物的體內(nèi)抗腫瘤活性研究則較少，而對于其抗結(jié)直腸癌活性的研究亦較少。鑒于阿福豆苷具有較好的抗結(jié)直腸癌應(yīng)用前景，我們以BABL/c小鼠作為模型，探討了阿福豆苷對于結(jié)直腸癌荷瘤小鼠的治療作用，期望為該化合物的應(yīng)用及結(jié)直腸癌的新藥研發(fā)提供一定的依據(jù)。

大量證據(jù)顯示，結(jié)直腸癌是典型的富血管惡性腫瘤，而血管生成作用可促進(jìn)該疾病的發(fā)生與發(fā)展，對于加劇結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長及浸潤具有顯著的作用[11]。VEGF是臨床已發(fā)現(xiàn)的最重要的促血管生成因子之一，該蛋白可特異性結(jié)合結(jié)直腸癌病灶組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞表面受體，從而產(chǎn)生較強(qiáng)的促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及促新生血管形成等作用；VEGFR-2則是機(jī)體中常見的VEGF受體，可與VEGF蛋白相互結(jié)合，并誘導(dǎo)VEGF的合成與釋放，介導(dǎo)多種促血管生成作用的信號傳導(dǎo)，在結(jié)直腸癌的血管生成過程中起到重要作用[18～20]；HIF-1α可提高癌細(xì)胞對缺氧環(huán)境的耐受性，從而加劇惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲性，該蛋白還可有效促進(jìn)VEGF及VEGFR-2的分泌，最終產(chǎn)生促血管生成的作用[21～23]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，高劑量阿福豆苷組、中劑量阿福豆苷組和低劑量阿福豆苷組小鼠腫瘤組織重量及腫瘤組織體積均降低，且腫瘤組織癌細(xì)胞出現(xiàn)大面積凋亡，而VEGFR-2、VEGF及HIF-1α等血管生成因子的陽性表達(dá)量少于模型組，提示阿福豆苷具有較好的抗腫瘤作用，且其主要作用機(jī)制可能為抗血管生成作用，然而對于其具體作用機(jī)制仍尚不明確，后期還應(yīng)該對該問題展開深入的探討。

綜上所述，阿福豆苷對結(jié)直腸癌小鼠具有較好的腫瘤抑制作用，具有作為抗結(jié)腸癌藥物的潛力，值得深入發(fā)掘。