GM-1預處理對布比卡因脊神經毒性模型大鼠脊髓組織JNK信號通路的影響

羅茜，劉本銓，吉杰梅，封青，劉敬臣

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021)

椎管內麻醉因其鎮痛效果確切、對全身血流動力學影響小、術中易于管理等優點，在臨床工作中被廣泛應用。布比卡因作為酰胺類局麻藥的代表藥物，是椎管內麻醉的常用藥物，但其被證實具有潛在的脊神經毒性[1]。椎管內麻醉后局麻藥神經毒性相關性并發癥主要有短暫性神經綜合征(TNS)、馬尾綜合征等[2]，一旦發生，則預示預后不良。因此迫切地需要尋找可能的治療藥物。單唾液酸四己糖神經節苷脂(GM-1)廣泛存在于神經細胞膜上，具有維持細胞膜上Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶穩定性、減輕細胞水腫、促進細胞存活、軸突生長和突觸形成的作用[3]，是治療脊髓外傷的常用藥物。動物和細胞研究均表明，GM-1可以治療布比卡因誘導的凋亡蛋白半胱天冬酶-3(Caspase-3)的表達，減輕神經元凋亡[4]，表明GM-1對布比卡因脊神經毒性有一定的治療作用。c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號通路作為細胞凋亡的調控通路之一，參與Caspase-3表達的調控[5]。研究表明，布比卡因神經細胞的毒性與JNK信號通路的激活相關[6]，而抑制JNK信號通路有利于脊髓外傷大鼠運動功能的恢復[7]。但5%布比卡因鞘內注射前，應用GM-1進行預處理能否通過調節JNK信號通路減輕布比卡因脊神經毒性，目前還未見報道。2018年3月～2019年3月，本研究旨在觀察GM-1預處理對布比卡因脊神經毒性大鼠JNK信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 SPF級成年雄性SD大鼠108只，體質量280～300 g(廣西醫科大學動物實驗中心提供)。PE-10導管(內徑0.28 mm，外徑0.61 mm，Smith Medical，英國)；GM-1(批號：國藥準字H20070243，阿根廷TRB公司)；布比卡因(Sigma公司)； YLS.12A型鼠尾光照測痛儀(淮北正華生物儀器設備有限公司，安徽)；蛋白酶K工作液(索萊寶公司)；TUNEL反應混合液(瑞士Roche公司)；DAB底物(武漢博士德生物工程公司)；蛋白酶抑制劑(索萊寶公司)；磷酸酶抑制劑(索萊寶公司)；RIPA裂解液(索萊寶公司)；4蛋白上樣緩沖液(索萊寶公司)；磷酸化JNK(p-JNK)一抗(Cell Signaling公司)；內參蛋白GAPDH一抗(Proteintech公司)；山羊抗小鼠熒光二抗(Licor公司)；Odessey紅外熒光掃膜儀器(Licor公司)；RNAiso(TaKaRa公司)；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa公司)；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ kit (TaKaRa公司)；JNK上游引物5′-ATCTCCGTAGACGAAGCTCTCCAG-3′ ；JNK下游引物：5′-GACGCCATTCTTAGTTCGCTCCTC-3′；GAPDH上游引物：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3′；GAPDH下游引物：5′-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3′(引物均來自生工生物有限公司)。

1.2 動物分組與蛛網膜下腔置管 按隨機數字表法均分為三組：生理鹽水組(saline組)、布比卡因組(S+B組)和GM-1預處理組(G+B組)各36只。采用改良Yaksh法[8]對各組大鼠行鞘內置管。預先用生理鹽水浸潤的PE-10導管于L5～L6椎間隙向頭端蛛網膜下腔置入導管1.5 cm，置入過程如見大鼠反射性甩尾及生理鹽水從導管口向外溢出，可證實導管在蛛網膜下腔。將導管固定于肌肉上，皮下埋管并將導管遠端從頸部穿出，在頸部皮膚開口處縫扎固定，火燒封口。置管后單籠飼養3 d，出現下肢運動障礙者剔除；其余大鼠鞘內注射2%利多卡因20 μL，注藥后30 s內出現雙下肢麻痹且30 min內恢復證明蛛網膜下腔置管成功，飼養2 d用于后續實驗，否則剔除。

1.3 干預方法 G+B組從導管向鞘內注射GM-1 30 mg/kg；saline組和S+B組同時鞘內注射等量生理鹽水。24 h后，S+B組、G+B組鞘內注入5%布比卡因0.12 μL/g 3次，每次間隔1.5 h；saline組同時注入等量生理鹽水。各組做完相應處理后，分別觀察0、1、3、5、7、14 d。

1.4 檢測指標

1.4.1 感覺功能及運動功能評價 ①感覺功能評價：行甩尾反應潛伏期(TFL)檢測。用鼠尾光照測痛儀于鞘內注射藥物前(基礎值)及注藥后(實測值)0、1、3、5、7、14 d，測定并記錄各組大鼠的TFL。測量3次，每次間隔5 min，取平均值，結果換算成最大抗輻射熱效應百分比(%MPE)，換算公式為：%MPE=(實測值-基礎值)/(最大值-基礎值)×100%。為避免組織損傷，TFL最大值為16.01 s。②運動功能評價：行后肢運動功能BBB評分[9]。0分為無可見的后肢運動，21分為運動功能正常。為避免大鼠晝夜痛域的差異，所有的測量均在早上9：00～11：00完成。

1.4.2 脊髓組織損傷觀察 TFL測定和BBB評分結束后，三組各時點隨機取6只大鼠，麻醉后用4 ℃生理鹽水經左心室灌注至肝臟發白。迅速取出腰膨大處脊髓組織。采用Takenami等介紹的評分方法進行脊髓組織損傷評分(SD評分)[1]。評分標準包括：①病變分布評分：取脊髓組織于4%多聚甲醛中固定，常規石蠟包埋，連續切片行HE染色光鏡下觀察。0分為沒有發現明顯病變；1分為病變僅局限于后根；2分為病變后根延伸至相應的白質區域。②病變嚴重程度評分：取脊髓后根1 mm×1 mm×2 mm，3%戊二醛磷酸緩沖液固定后，電鏡下觀察后根及白質。0分為無病變；1分為輕度病變(局部的髓鞘和軸突病變)；2分為中度病變(分級1～3分)；3分為嚴重病變(彌漫性的髓鞘和軸突病變)。脊髓組織損傷評分為病變分布評分與嚴重程度評分之和。

1.4.3 脊髓組織細胞凋亡檢測 采用TUNEL法。將石蠟包埋脊髓組織切片，片厚3 μm。組織切片經脫蠟水化，滴加蛋白酶K工作液，37 ℃條件下反應15 min。滴加TUNEL反應混合液至組織切片，37 ℃暗濕盒中反應1 h；PBS漂洗，滴加DAB底物，暗濕盒(37 ℃)中反應10 min；PBS漂洗、蘇木素復染、梯度乙醇脫水、甲苯透明、中性樹膠封片；在光學顯微鏡對每個樣品的5個隨機鏡下觀察陽性細胞，Image J軟件分析計算陽性細胞百分比。

1.4.4 脊髓組織p-JNK蛋白表達檢測 采用Western blotting法。凍存脊髓組織加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液于冰上研磨，低溫離心，吸取上清。BCA法測定并記錄各蛋白樣品的濃度。加入蛋白上樣緩沖液混勻，煮沸變性后備用。各蛋白樣品中吸取等量蛋白于10%SDS-PAGE膠中電泳分離，濕轉法轉移蛋白至PVDF膜。p-JNK一抗(稀釋比1∶1 000)和內參蛋白GAPDH一抗(稀釋比1∶3 000)搖床上4 ℃孵育PVDF膜過夜，TBST洗膜。山羊抗小鼠熒光二抗(1∶5 000)室溫孵育PVDF膜1～2 h，TBST洗膜。Odessey紅外熒光掃膜儀器掃描所得PVDF膜。掃描結果采用Image J軟件分析，以p-JNK蛋白條帶灰度值和內參蛋白GAPDH條帶灰度值的比值反映p-JNK蛋白相對表達水平。

1.4.5 脊髓組織JNK基因表達檢測 采用qRT-PCR法。RNAiso提取總RNA。PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser將所得總RNA逆轉錄為cDNA。SYBR Premix Ex Taq Ⅱ kit檢測目的基因JNK及內參基因GAPDH的表達。JNK mRNA含量根據每個樣本的GAPDH含量進行標準化，結果用相對定量2-ΔΔCt法分析。

2 結果

2.1 各組感覺功能比較 注藥后各時點，S+B組、G+B組的%MPE均高于saline組(P均<0.05)；注藥后3、5、7、14 d，G+B組的%MPE低于S+B組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組感覺功能比較

注：與saline組比較，*P<0.05；與S+B組比較，#P<0.05。

2.2 各組運動功能比較 saline組各時間點的BBB評分均為21分。注藥后0、1、3、5、7、14 d，S+B組、G+B組的BBB評分均低于相應時間點的saline組(P均<0.05)；注藥后5、7、14 d，G+B組BBB評分均高于表S+B組(P均<0.05)。見表2。

2.3 脊髓組織病理學改變 ①光鏡下，saline組在各時間點灰質和白質結構致密，神經元形態規則、輪廓清晰，內含有豐富的尼氏體，神經元纖維平行排列成束；S+B組、G+S組在注藥后0、1、3、5、7、14 d，脊髓灰質和白質內均有大小和數量不等的空泡形成，神經元水腫或萎縮，且數量減少，細胞核固縮、深染，神經纖維排列紊亂；與相應時間點的S+B組相比，注藥后5、7、14 d，G+B組脊髓灰質和白質結構較為致密，空泡減少，水腫程度減輕，神經元和軸突數量較多。②電鏡下，saline組各時間點髓鞘致密，內質網形態正常，染色質染色均勻，胞核清晰完整；S+B組、G+B組給藥后各時點均出現不同程度的脫髓鞘變化，軸漿萎縮，內質網腫脹、起泡，核膜皺縮、溶解，染色質邊集。與相同時點S+B組的彌漫性軸漿萎縮和脫髓鞘變化相比，G+B組在5、7、14 d的軸突損傷程度較輕，且范圍較為局限。見圖1。③給藥后各時點，S+B組、G+B組的組織損傷評分均比相應時點的saline組高(P<0.05)。給藥后第5 d、7 d、14 d，G+B組SD評分比相應時點的S+B組低(P<0.05)。見表3。

表2 各組不同時點BBB評分比較[分，M(Q)]

注：與saline組比較，*P<0.05；與S+B組比較，#P<0.05。

注：A為S+B組7 d時(×8 000)；B為S+B組14 d時(×20 000)；C為G+B組7 d時(×20 000)；D為G+B組14 d時(×20 000)。

圖1 各組脊髓組織超微結構表現(透射電鏡法)

注：與saline組比較，*P<0.05；與S+B組比較，#P<0.05。

2.4 各組脊髓組織細胞凋亡率比較 給藥后各時點，S+B組、G+B組脊髓細胞凋亡率均高于相應時點saline組(P均<0.05)；給藥后5、7、14 d，G+B組脊髓細胞凋亡率均低于相應時點S+B組(P均<0.05)。見表4。

2.5 各組脊髓組織p-JNK蛋白表達比較 S+B組、G+B組p-JNK相對表達量均高于相應時間點saline組(P<0.05)；給藥后第5、7 d，G+B組p-JNK相對表達量均低于相應時點S+B組(P均<0.05)。見圖2、表5。

表4 各組脊髓組織細胞凋亡率比較

注：與saline組比較，*P<0.05；與S+B組比較，#P<0.05。

2.6 各組脊髓組織JNK mRNA表達比較 給藥后各時點，S+B組、G+B組JNK mRNA相對表達量均高于相應時點saline組(P<0.05)；給藥后3、5、7 d，G+B組JNK mRNA相對表達量均高于相應時點S+B組(P<0.05)。見表6。

注：A為S+B組各時點蛋白表達量；B為S+B組、G+B組、saline組注藥后5、7 d蛋白表達量。

圖2各組脊髓組織p-JNK蛋白表達比較(Western blotting法)

表5 各組脊髓組織p-JNK蛋白表達比較

注：與saline組相比較，*P<0.05；與S+B組比較，#P<0.05。

表6 各組脊髓組織JNK mRNA表達比較

注：與saline組比較，*P<0.05；與S+B組比較，#P<0.05。

3 討論

5%布比卡因鞘內注射引起神經毒性的病理基礎是誘導大鼠脊髓神經元的凋亡[1]。布比卡因導致的神經毒性是多機制多通路共同調控的過程：內質網應激凋亡通路[10]、p38 MAPK通路[11]等都參與其中。JNK信號通路是MAPK信號通路的一部分，與內質網應激凋亡通路密切相關。在內質網應激情況下，JNK蛋白磷酸化成為活性形式p-JNK蛋白[12]。p-JNK蛋白磷酸化并激活c-Jun蛋白，c-Jun蛋白作為激活蛋白-1(AP-1)的組成部分，參與激活與細胞凋亡相關的下游基因[13]。此外，p-JNK蛋白還可以調控內源性凋亡通路中Casepase-3[5]和Bcl-2家族[12]的表達，間接誘導細胞凋亡。

GM-1已被廣泛應用于脊髓外傷[14]、腦缺血再灌注損傷[15]的治療。研究表明，在注射5%布比卡因前，應用GM-1預處理，可以抑制內質網應激GRP78/PERK/eIF2α/ATF4通路[11]，部分減輕5%布比卡因的脊神經毒性。但目前，GM-1對5%脊髓神經毒性的治療作用和JNK信號通路是否有關聯，尚未見報道。

本研究發現，注藥后各時點saline組感覺和運動功能未見明顯改變，脊髓組織無病變或神經元凋亡，表明置管操作未對大鼠脊髓造成傷害；S+B、G+B組的感覺運動功能均有不同程度的損害，組織損傷評分和細胞凋亡率高于相應時點的saline組，表明5%布比卡因脊神經毒性模型建立成功；各時點S+B組、G+B組JNK mRNA和p-JNK蛋白的表達量均高于相應時點的saline組，表明5%布比卡因激活了JNK信號通路，5%布比卡因導致脊神經毒性與JNK信號通路的激活相關。

本研究發現，給藥后3、5、7、14 d時，G+B組感覺功能優于S+B組；5、7、14 d，G+B組運動功能優于相應時點的S+B組，組織損傷評分和細胞凋亡率低于相應時點的S+B組，表明GM-1預處理可以減輕5%布比卡因的神經毒性；給藥后3、5、7 d，G+B組JNK mRNA的相對表達量低于相應時點的S+B組；給藥后5、7 d，G+B組p-JNK的相對表達量低于相應時點的S+B組，表明GM-1預處理減輕5%布比卡因脊神經毒性的機制與抑制JNK信號通路的激活相關。本研究表明，GM-1預處理可以抑制5%布比卡因引起的JNK信號通路激活，減輕其脊神經毒性，表明GM-1具有神經保護作用，闡明其發揮神經保護作用的又一機制。

然而，本研究發現，與S+B組相比，G+B組在給藥后3、5、7、14 d，有一定程度的好轉，但JNK信號通路的功能執行者p-JNK蛋白的表達量在僅在給藥后5、7 d有所降低。感覺運動功能恢復、細胞凋亡率降低、組織病理損傷程度減輕的時間，與JNK信號通路受到抑制的時間并不完全一致。提示JNK信號通路的抑制可能只是GM-1預處理減輕布比卡因脊神經毒性的機制之一，仍然有其他機制共同參與這一過程。

本研究發現，與saline組相比，給藥后各時點G+B組的感覺運動功能、組織細胞結構受到不同程度的損傷，細胞凋亡率均升高，提示GM-1預處理僅能部分地減輕而不能完全消除布比卡因脊神經毒性。與saline組相比，給藥后各時點G+B組JNK mRNA和p-JNK蛋白的相對表達量均升高，提示GM-1預處理僅能部分地抑制而不能完全消除JNK信號通路的激活。應用JNK特異性抑制劑SP600125完全抑制JNK信號通路，能否更大程度地減輕5%布比卡因的脊神經毒性，仍然有待進一步驗證。

綜上所述，GM-1預處理可以減輕大鼠鞘內注入布比卡因引起的脊神經毒性，改善大鼠的感覺、運動功能，減輕神經細胞凋亡和病變，其機制與抑制JNK信號通路的激活有關。