右美托咪定預處理對新生期吸入七氟醚大鼠青年及成年期海馬神經元凋亡的影響

梁小麗，張潔，劉程曦，張超，徐珊，張益2,，朱昭瓊

(1遵義醫科大學附屬醫院，貴州遵義563000；2貴州省麻醉與器官保護基礎研究重點實驗室；3遵義醫科大學麻醉醫學院；4遵義醫科大學第二附屬醫院)

七氟醚因具有誘導蘇醒快、對血流動力學影響較小等優點，在臨床上常用于小兒麻醉。但是有研究顯示，新生期重復吸入七氟醚可發生遠期學習記憶能力下降，可能與七氟醚導致海馬神經元凋亡有關[1]。因此，如何預防七氟醚吸入引起的海馬神經元凋亡逐漸成為研究熱點。右美托咪定(Dex)是一種α2腎上腺受體激動劑，具有安全性高、不良反應少等優點，同時，Dex還可顯著改善吸入麻醉藥如七氟醚等所引起的術后認知功能障礙[2]，但其是否可以減輕新生期吸入七氟醚后引起的遠期海馬神經元凋亡尚不明確。2017年1月～2018年12月，本研究觀察了Dex預處理對新生期吸入七氟醚大鼠青年期及成年期海馬神經元凋亡的影響，為臨床預防或減輕七氟醚的大腦毒性作用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料 健康7日齡SD雄性大鼠60只，體質量11～20 g，購于重慶第三軍醫大學實驗動物中心。七氟醚(批號：65130704)購自山東魯南制藥公司，兔抗鼠激活型Caspase-3一抗、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗購自美國Santa Cruz公司，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天公司，Fabius麻醉機及Va-mos氣體監護儀購自德國Drager公司，低溫高速離心機購自美國Thermo Fisher Scientific公司，電泳儀、濕轉轉膜儀、曝光儀購自美國Bio-Rad公司，正置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 動物分組及干預方法 將60只健康7日齡SD雄性大鼠采用數字表法隨機分為七氟醚組、Dex預處理組和空白對照組，每組20只。七氟醚組于出生后第7、14、21天腹腔注射3 mL/kg生理鹽水，20 min后吸入2.6%七氟醚+運載氣體(O21 L/min +空氣1 L /min)4 h。Dex預處理組將Dex稀釋為6.7 μg/mL，腹腔注射劑量為20 μg/kg，其余處理同七氟醚組。空白對照組采用相同的方法腹腔注射生理鹽水并吸入運載氣體4 h。實驗期間將大鼠放置在自制的吸入麻醉箱中，箱底鋪一薄層鈉石灰，吸入過程中用自制水浴箱加熱控制箱溫在30～34 ℃，氣體監測儀持續監測保證進氣孔和出氣孔七氟烷濃度一致。監測麻醉過程中的呼吸頻率和皮膚色澤，若大鼠發生缺氧則予以排除。

1.3 海馬神經元凋亡情況檢測 采用TUNEL法。三組分別于青年期(37日齡)和成年期(97日齡)隨機選取5只大鼠，腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉，采用4%多聚甲醛PB液行心臟灌注，取整個腦組織，將其置于相同固定液中48 h。待組織固定后，行常規脫水、浸蠟、包埋，切片機行冠狀連續切片，厚度4 μm。經乙醇脫蠟、水化、封片，嚴格按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明進行操作。于200倍光鏡下隨機觀察并計數海馬CA1區5個不重復視野棕褐色TUNEL陽性神經元數量，計算平均值。

1.4 海馬組織激活型Caspase-3表達檢測 采用Western blotting法。三組分別于青年期(37日齡)和成年期(97日齡)隨機選取5只大鼠，腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉，快速斷頭取腦，冰上分離海馬組織。加入細胞裂解液，提取海馬組織蛋白，BCA法進行蛋白定量。取50 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉膜、封閉。加入兔抗鼠激活型Caspase-3一抗(稀釋比例1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(稀釋比例1∶8 000)，常溫孵育1 h后曝光成像。采用Image J軟件檢測蛋白條帶灰度值，激活型Caspase-3蛋白相對表達量以激活型Caspase-3與內參蛋白β-actin灰度值的比值表示。

2 結果

2.1 三組不同時期海馬凋亡神經元數量比較 七氟醚組、Dex預處理組、空白對照組青年期海馬凋亡神經元數分別為(1.6±1.5)、(23.6±6.7)、(3.6±1.1)個，成年期分別為(2.0±1.2)、(20.4±6.3)、(3.6±2.1)個；七氟醚組青年期和成年期海馬凋亡神經元數量多于同期Dex預處理組和空白對照組(P均<0.01)，空白對照組與Dex預處理組同期組間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。三組青年期與成年期海馬凋亡神經元數量組內比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見圖1。

注：箭頭所指為TUNEL陽性細胞。

圖1三組青年期和成年期海馬組織細胞凋亡情況(TUNEL法)

2.2 三組不同時期海馬組織激活型Caspase-3相對表達量比較 七氟醚組、Dex預處理組和空白對照組青年期海馬組織激活型Caspase-3相對表達量比較分別為0.47±0.08、0.18±0.02、0.16±0.03，成年期分別為0.39±0.04、0.17±0.06、0.15±0.02；七氟醚組青年期和成年期海馬組織激活型Caspase-3相對表達量均高于同期Dex預處理組和空白對照組(P均<0.01)，空白對照組與Dex預處理組同期組間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。三組青年期與成年期海馬組織激活型Caspase-3相對表達量組內比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見圖2。

圖2 三組青年期和成年期海馬組織激活型Caspase-3表達情況(Western blotting法)

3 討論

七氟醚具有血氣分配系數低、吸收清除較快、氣道刺激性小等優點，常用于小兒麻醉的誘導與維持[3]。每天大量新生期患兒接受七氟醚麻醉，而新生期七氟醚暴露是否會引起患兒在學齡期和成年期學習記憶能力降低，是患兒父母乃至社會廣泛關注的問題[4]。然而，由于臨床研究觀察周期較長，目前對于這一問題尚未得出確切結論[5]。大量動物實驗顯示，新生期重復七氟醚暴露可引起遠期海馬神經元凋亡，同時長期抑制海馬神經元長時程增強(LTP)，導致動物幼年期和成年期學習記憶能力下降[6～8]。Caspase是一類存在于細胞質中的半胱氨酸特異性蛋白酶，其多種亞型在細胞凋亡過程中均發揮重要作用[9]。其中凋亡蛋白酶Caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，也是多種凋亡途徑的共同下游效應部分，其活化是凋亡進入不可逆階段標志，激活后的Caspase-3可切割DNA依賴的蛋白激酶與聚腺苷二磷酸核糖多聚酶等，由此影響DNA的復制、轉錄和修復[10]。本研究結果顯示，七氟醚組青年期和成年期海馬凋亡神經元數量、激活型Caspase-3相對表達量均高于同期空白對照組；說明大鼠新生期重復七氟醚吸入后，在青年期和成年期時海馬神經元凋亡增加，與之前報道的新生期重復七氟醚暴露可導致青年期和成年期突觸的長時程和短時程可塑性損害一致[11]，而海馬神經元凋亡可能是其功能發生改變的病理基礎。

Dex可通過激活大腦內的α2腎上腺素能受體發揮鎮靜催眠作用，同時也有研究顯示，Dex對吸入麻醉藥如異氟醚所致神經毒性有顯著的即時保護作用[12]。Dex的腦保護作用機制可能涉及PI3K/Akt通路：Dex預處理可恢復異氟醚導致的磷酸化Akt水平下調、Bad蛋白表達上調以及Bcl-xL/Bad比例下降，而應用PI3K抑制劑可部分消除Dex的神經保護作用[13]。此外，促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)超家族中的p38和c-jun氨基末端激酶(JNK)抑制劑也可部分消除Dex的神經保護作用，說明Dex也可能通過這兩條通路減輕異氟醚所致的新生期神經元凋亡[14]。Dex也可減輕七氟醚導致的發育期神經毒性作用。研究顯示，Dex可通過下調Drp1蛋白和Bax蛋白表達、上調Bcl2表達，同時改善七氟醚導致的自噬和線粒體動力學異常，最終發揮神經保護作用[15]。然而，Dex是否可以減輕七氟醚的遠期毒性作用目前尚不清楚。本研究結果顯示，Dex預處理組青年期和成年期海馬凋亡神經元數量、激活型Caspase-3相對表達量均低于同期七氟醚組，與空白對照組同期組間比較均無統計學差異；說明Dex預處理可有效減輕新生期大鼠吸入七氟醚的遠期毒性作用。而對于這種長期的腦保護機制是否與既往報道的中短期保護機制相同，仍需進行更深入的研究。

綜上所述，Dex預處理可顯著減少新生期吸入七氟醚大鼠青年期和成年期海馬神經元凋亡，由此減輕七氟醚的遠期毒性作用，從而保護腦組織。Dex預處理的方法簡便易行，可為臨床上防治七氟醚對患兒學習記憶能力的長期影響提供新的思路。