血清miR-483-5p、miR-21和miR-25檢測在非小細胞肺癌診斷中的價值

李世榮，劉艷，王振明，宋明澤，焦紅娟

(1濰坊市人民醫(yī)院，山東濰坊261041；2濰坊醫(yī)學院臨床檢驗診斷學系；3巨野縣人民醫(yī)院)

肺癌是世界上發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，且近年來有不斷上升的趨勢[1,2]。許多患者就診時已經處于晚期階段，喪失了早期治療的機會。由于非小細胞肺癌(NSCLC)占肺癌的大多數，因此，尋找高敏感度和特異度的NSCLC標志物具有重要的臨床意義。MicroRNAs(miRNAs)是一類長度為20～25個堿基的具有調節(jié)功能的非編碼RNA，不僅能通過互補堿基配對方式識別靶mRNA，降解靶mRNA或抑制靶mRNA的翻譯[3]，還可以與細胞中的原癌基因和腫瘤抑制因子相互作用[4,5]，從而參與癌基因的表達。研究表明，肺癌患者血清miRNAs表達譜變化與肺癌病情變化具有直接的關系，其在肺癌早期診斷中具有重要價值[6]。本研究分析血清hsa-miRNA-483-5p(miR-483-5p)、hsa-miRNA-21(miR-21)和has-miRNA-25(miR-25)在NSCLC患者血清中的表達及其診斷價值，并與常用的NSCLC腫瘤標志物癌胚抗原(CEA)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)和非小細胞肺癌相關抗原21-1(CYFRA21-1)進行比較。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年9月～2016年5月濰坊市人民醫(yī)院呼吸科收治的NSCLC患者32例作為NSCLC組，男21例、女11例，年齡(60±9)歲，TNM分期Ⅰ～Ⅱ期10例，Ⅲ～Ⅳ期22例。淋巴結轉移20例。組織學類型包括腺癌13例、鱗癌14例、其他5例。所有患者均經纖維支氣管鏡活檢或穿刺活檢或外科手術標本取樣，經病理組織學檢查確診，排除肺癌以外的其他系統(tǒng)腫瘤。選擇非腫瘤性良性肺病(NCPD)包括肺炎、肺結核、肺纖維化等患者22例作為NCPD組，男13例、女9例，年齡(61±9)歲。另選擇健康查體者20例作為Control組，男11例、女9例，年齡(59±7)歲。各組年齡、性別比例差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2 標本采集 抽取靜脈血5 mL于含分離膠的試管中，室溫下靜置1 h。室溫4 100 r/min，離心10 min，收集血清于分離管中。

1.3 血清CEA、NSE和CYFRA21-1水平檢測 用Roche公司的Cobas e601電化學發(fā)光免疫分析儀及其配套試劑盒，測定血清CEA、NSE和CYFRA21-1水平，按照說明書操作。

1.4 血清miR-483-5p、miR-21、miR-25表達檢測

1.4.1 RNA提取 采用傳統(tǒng)的苯酚-氯仿提取方法，并在加入苯酚后加入2 μL 25 fmol/L人工合成的線蟲cel-mir-39作為外源性內參。提取好的RNA放在-80 ℃儲存。

1.4.2 PCR反應 cDNA合成試劑盒購自美國ABI公司，針對每一種miRNA設計一條含有莖環(huán)結構的基因特異性反向引物，利用miRNA特異性反向引物進行逆轉錄，得到含共同莖環(huán)結構但屬于特定microRNA的cDNA。每個逆轉錄反應的總體積為15 μL，其中包括7 μL RT混合物(0.15 μL dNTP、1.00 μL 酶、1.50 μL RT緩沖液、0.19 μL RNA酶抑制劑、4.16 μL無酶的DEPC水)、5 μL總RNA和3 μL RT引物。PCR條件參數為：16 ℃、15 min，42 ℃、1 h，85 ℃、5 min，得到cDNA。反應結束后立即將cDNA產物取出，快速置冰上冷卻，產物置于-20 ℃冰箱保存以備用。

1.4.3 實時熒光定量PCR 采用熒光探針方法檢測樣本中RNA的含量。反應體系包括1.33 μL RT產物，1.00 μL 20×TaqMan miRNA Assay(ABI)，10.00 μL 2×TaqMan通用PCR混合物(ABI)和7.67 μL無酶的DEPC水。擴增參數為：95 ℃、5 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，40個循環(huán)。每個樣品加3個復孔。miRNAs的相對表達量用2-ΔΔCt的方式來計算，ΔΔCt=(實驗組Ct-cel-mir-39 Ct)-(Control組Ct-cel-mir-39 Ct)。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用GraphPad Prism 5.01和SPSS17.0統(tǒng)計軟件。三組間比較采用非參數Kruskal-WallisH檢驗，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。血清CEA、NSE及CYFRA21-1數據呈偏態(tài)分布，用中位數(四分位數)[M(P25～P75)]表示。用受試者工作特征曲線(ROC)確定miRNAs和CEA、NSE及CYFRA21-1診斷NSCLC的曲線下面積(AUC)、敏感度和特異度。敏感度和特異度比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組血清CEA、NSE、CYFRA21-1水平比較 NSCLC組血清CEA、NSE、CYFRA21-1水平均高于Control組(U分別為191.00、100.50、143.00，P分別為0.015、0.000、0.001)。見表1。

2.2 血清CEA、NSE、CYFRA21-1單項及聯合檢測診斷NSCLC的ROC分析 CEA、NSE、CYFRA21-1及CEA+NSE+CYFRA21-1聯合檢測診斷NSCLC的AUC分別為0.702(95%CI為0.560～0.843)、0.843(95%CI為0.733～0.953)、0.777(95%CI為0.652～0.901)、0.898(95%CI為0.815～0.982)。CEA、NSE、CYFRA21-1及CEA+NSE+CYFRA21-1聯合檢測診斷NSCLC的敏感度分別為56.25%、68.75%、71.88%及90.65%，特異度分別為95.00%、90.00%、70.00%、60.00%。見圖1。

表1 各組血清CEA、NSE、CYFRA21-1水平比較[μg/L，M(P25～P75)]

注：與Control組比較，*P<0.05，﹟P<0.01。

圖1 血清CEA、NSE和CYFRA21-1單項及聯合檢測檢測診斷NSCLC的ROC分析

2.3 各組miR-483-5p、miR-21、miR-25表達比較 NSCLC組miR-483-5p、miR-21表達均高于NCPD組及Control組(P均<0.05)。NSCLC組miR-25表達低于NCPD組及Control組(P均<0.05)。NCPD組與Control組miR-483-5p、miR-21、miR-25表達差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見圖2。

2.4 miR-483-5p、miR-21、miR-25診斷NSCLC的ROC分析 miR-483-5p、miR-21、miR-25對NSCLC的AUC分別為0.944(95%CI為0.882 2～0.990 5)、0.966(95%CI為0.924 3～0.991 7)、0.886(95%CI為0.791 3～0.980 6)。miR-483-5p、miR-21和miR-25診斷NSCLC的敏感度分別為93.80%、84.40%、81.25%，特異度分別為90.00%、100%、95.00%。見圖3。

2.5 miRNAs和CEA、NSE、CYFRA21-1及CEA+NSE+CYFRA21-1診斷NSCLC的AUC、敏感度及特異度比較 miRNA-483-5p、miRNA-21和miRNA-25診斷NSCLC的AUC均較高于單一腫瘤標志物的ROC-AUC明顯增高。經χ2檢驗，miR-483-5p、miR-21、miR-25診斷NSCLC的敏感度與CEA+NSE+CYFRA21-1聯合診斷差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.217，P=0.641；χ2=0.571，P=0.450；χ2=1.164，P=0.281)。

圖2 各組miR-483-5p、miR-21、miR-25表達水平比較

圖3 miRNA-483-5p、miRNA21和miRNA-25單項檢測診斷NSCLC的ROC分析

3 討論

miRNAs能夠調控基因表達，起到癌基因或抑癌基因的作用，與肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。近年研究發(fā)現，miRNAs以被保護狀態(tài)穩(wěn)定存在于循環(huán)血液中，因此miRNAs很可能成為肺癌輔助診斷的非侵入性分子標志物。研究發(fā)現，miRNAs在診斷NSCLC方面具有較高的敏感度和特異度，但由于檢測方法等多種因素的影響，不同研究者的結果差異很大，甚至相反[7～10]。我們選擇3個在肺癌中具有很高敏感性的miRNAs，miR-483-5p、miR-21和miR-25作為本研究的對象，觀察它們在NSCLC診斷中的價值，并與CEA、NSE、CYFRA21-1等常用的肺癌標志物作比較，為將來的臨床應用提供實驗基礎。

研究發(fā)現，miR-483-5p通過直接靶向Rho因子鳥苷酸解離抑制因子1(RhoGDI1)和活化的白細胞黏附分子(ALCAM)，促進細胞的上皮—間質轉化，從而促進肺癌的轉移[11]。Toll樣受體4(TLR4)/活性氧(ROS)/miR-21途徑在LPS誘導的原發(fā)性肺癌生長中具有重要作用，miR-21的上調促進原代人肺癌細胞的生長，miR-21的下調則限制了原代人肺癌細胞的生長[12]。通過上調程序性細胞死亡因子4(PDCD4)可以抑制miR-21表達，從而可以減少腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲[13]。研究發(fā)現，miR-25在肺癌干細胞的祖細胞中表達是下調的，并且可能參與了支氣管肺泡干細胞向肺癌干細胞的轉化[14]。K-Ras突變在肺癌中經常發(fā)生，miR-25與絲裂原活化蛋白激酶(Ras-MAPK)信號通路密切相關，表明miR-25可能與肺癌的發(fā)生有關[15]。本研究結果顯示，NSCLC組miR-483-5p、miR-21表達均高于NCPD組及Control組，NSCLC組miR-25表達低于NCPD組及Control組，表明NSCLC患者血清miR-483-5p、miR-21表達上調，miR-25表達下調；miR-483-5p、miR-21、miR-25對NSCLC的AUC分別為0.944、0.966、0.886，敏感度分別為93.80%、84.40%、81.25%，特異度分別為90.00%、100%、95.00%。

CEA、NSE、CYFRA21-1是臨床上已常規(guī)應用于NSCLC輔助診斷的腫瘤標志物，但敏感性和特異度均有待于進一步提高。本研究結果表明，NSCLC組血清CEA、NSE、CYFRA21-1水平均高于Control組，CEA、NSE、CYFRA21-1及CEA+NSE+CYFRA21-1聯合檢測診斷NSCLC的敏感度分別為56.25%、68.75%、71.88%及90.65%，特異度分別為95.00%、90.00%、70%、60.00%，CEA+NSE+CYFRA21-1聯合檢測大幅提高了NSCLC輔助診斷的敏感度。本研究發(fā)現，miR-483-5p、miR-21、miR-25診斷NSCLC的敏感度均達到了CEA+NSE+CYFRA21-1聯合診斷的敏感度，表明miRNA-483-5P、miRNA21和miRNA-25作為NSCLC輔助診斷的腫瘤標志物，其在敏感度方面優(yōu)于傳統(tǒng)腫瘤標志物。

綜上所述，miRNA-483-5P、miRNA21和miRNA-25可以作為非侵入性的腫瘤標志物，用于NSCLC的輔助診斷，具有很高的敏感度。