miR-21靶向調(diào)控PDCD4在四逆湯減輕大鼠心肌細胞損傷中的意義

梁麗英，劉歡，張永琴，陳煒，陳晶

(1廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學分子生物實驗室，南寧530023；2廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院臨床藥理基地；3廣西中醫(yī)藥大學中醫(yī)基礎(chǔ)研究重點實驗室)

隨著我國人口快速老齡化，心血管疾病在我國逐漸成為一種常見疾病。研究表明，心肌細胞凋亡是存在于多種心血管疾病中的共同病理現(xiàn)象，微小RNA-21(miR-21)在抗心肌細胞凋亡上具有重要作用，可通過調(diào)節(jié)靶基因程序性細胞死亡因子4(PDCD4)的表達，調(diào)控血管平滑肌細胞和心肌細胞的凋亡、增殖，并參與氧化應(yīng)激引起的細胞損傷[1]。中醫(yī)認為心血管疾病具有共同的中醫(yī)病理基礎(chǔ)，本虛是心血管疾病的必要條件。四逆湯為東漢名醫(yī)張仲景所創(chuàng)，收錄于《傷寒論》，由附子、干姜、甘草組成，為溫腎回陽救逆之名方。研究顯示，四逆湯具有強心、耐缺氧、升壓、抗休克、保護缺血心肌等藥理作用[2,3]，但其主要的機制仍不清楚，其能否調(diào)控miR-21的表達，從而影響心肌細胞的凋亡鮮見報道。2017年4月～2018年6月，我們通過體外建立大鼠心肌細胞損傷模型，探討四逆湯對阿霉素誘導的心肌細胞損傷的保護作用，并探討其可能機制，為四逆湯拮抗心肌細胞損傷的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 動物與細胞 SPF級SD大鼠20只，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司[動物生產(chǎn)/使用許可證號：SCXK(湘)2014-0011]提供。大鼠心肌細胞H9C2由上海生命科學研究院細胞資源中心提供。

1.1.2 藥品與試劑 四逆湯(附子15 g、干姜9 g、炙甘草6 g，由單味中藥濃縮顆粒而成)。miR-21 mimic和miR-21 inhibitor(上海吉凱科技公司)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸(EDTA,美國Gibco公司)；凋亡試劑盒Annexinv-APC/PI(美國BD公司)；二甲基亞砜(DMSO)為分析純；CCK-8試劑盒(日本Dojindo Molecular Technologies公司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒試劑盒、TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ熒光定量試劑盒(日本Takala公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS,北京索萊寶公司)；水為超純水。

1.1.3 儀器 CytoFlex型流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)；5410型低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)；BSC-1300Ⅱ B2型生物安全柜(上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司)；371型CO2培養(yǎng)箱、Multiskan FC型酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；IX71型倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；7500 Fast型實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司)。

1.2 四逆湯含藥血清制備及濃度篩選

1.2.1 四逆湯組成 附子、干姜、生甘草劑量比例為5∶3∶2。

1.2.2 含藥血清與正常對照血清制備 SD大鼠20只，取四逆湯顆粒，超純水加熱溶解，給予3.8 g/(kg·d)(用藥劑量按人與動物體質(zhì)量換算)，2 mL/只灌胃[4]，每日灌胃給藥1次，連續(xù)給藥14 d，于末次給藥1 h后，以戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，分離血清，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過后，于56 ℃水浴中滅活補體30 min，得四逆湯含藥血清。同期飼養(yǎng)SD大鼠10只，雌雄各半，體質(zhì)量約為200 g，每日灌胃生理鹽水1次，14 d后同樣方法取血，分離血清，得正常對照血清。

1.2.3 四逆湯含藥血清濃度篩選

1.2.3.1 H9C2細胞培養(yǎng) H9C2接種于培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM為培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液。待細胞長至80%左右，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.3.2 適合心肌細胞生長的四逆湯含藥血清濃度篩選 將H9C2細胞以1×105/mL的密度接種至96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL。預(yù)培養(yǎng)24 h，隨機分為正常血清組和四逆湯含藥血清組，每組再分三個濃度水平，其中正常血清組分別加入10%、5%、2.5%含正常大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基，四逆湯含藥血清組分別加入10%、5%、2.5%四逆湯含藥血清的DMEM培養(yǎng)基。每組設(shè)3個復(fù)孔，將培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24、48、72 h后，向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度(以O(shè)D值表示)，篩選DMEM培養(yǎng)基中最適合心肌細胞生長的四逆湯含藥血清濃度及作用時間。結(jié)果表明10%四逆湯含藥血清作用72 h后，細胞增殖明顯增加，因此將10%含四逆湯藥血清、作用72 h作為后續(xù)實驗條件。

1.3 miR-21 mimic、miR-21 inhibitor細胞系構(gòu)建 miR-21 mimic和miR-21 inhibitor腺病毒載體由上海吉凱科技公司設(shè)計并化學合成，分裝于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩9C2單細胞懸液接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)(1×105/mL)，細胞長至約80%時，加入重組慢病毒miR-21 mimic，以50 MoI滴度轉(zhuǎn)染心肌細胞H9C2，24 h后吸棄培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后熒光顯微鏡及流式細胞儀觀察轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率90%以上達到要求，傳代細胞備用。同樣方法構(gòu)建miR-21 inhibitor細胞系。熒光相差倒置顯微鏡下可見細胞形態(tài)完整，呈纖維狀，大部分細胞顯綠色熒光。陰性對照陽性表達率為0.04%，轉(zhuǎn)染miR-21 mimic陽性表達率為96.13%，轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor陽性表達率為96.34%，轉(zhuǎn)染效率均達到90%以上，形態(tài)學和定量檢測表明miR-21 mimic、miR-21 inhibitor均轉(zhuǎn)染成功。

1.4 細胞分組及給藥處理 細胞分別給予阿霉素損傷和無阿霉素處理，再各分為四個水平，分別加入miR-21 mimic、miR-21 inhibitor、四逆湯+miR-21 mimic、四逆湯+miR-21 inhibitor，另設(shè)正常對照組及四逆湯組。共10組：正常對照組取H9C2細胞，在含10%正常大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)；四逆湯組取H9C2細胞，在含10%正常大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基中加入四逆湯含藥血清培養(yǎng)；miR-21 mimic組取miR-21 mimic細胞系培養(yǎng)；miR-21 inhibitor組取miR-21 inhibitor細胞系培養(yǎng)；四逆湯+miR-21 mimic組取miR-21 mimic細胞系，加入四逆湯含藥血清培養(yǎng)；四逆湯+miR-21 inhibitor組取miR-21 inhibitor細胞系，加入四逆湯含藥血清培養(yǎng)；ADR+miR-21 mimic組取miR-21 mimic細胞系，加入含阿霉素濃度為10 μg/mL的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)液，PBS輕洗1次，繼續(xù)培養(yǎng)；ADR+miR-21 inhibitor組取miR-21 inhibitor細胞系，加入含阿霉素濃度為10 μg/mL的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗1次，繼續(xù)培養(yǎng)；ADR+四逆湯+miR-21 mimic組取miR-21 mimics細胞系，加入含阿霉素濃度為10 μg/mL的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)液，PBS輕洗1次，加入四逆湯含藥血清培養(yǎng)；ADR+四逆湯+miR-21 inhibitor組取miR-21 inhibitor細胞系，加入含阿霉素濃度為10 μg/mL的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)液，PBS輕洗1次，繼續(xù)培養(yǎng)，加入四逆湯含藥血清培養(yǎng)。每個濃度組設(shè)3個平行孔。

1.5 細胞miR-21、PDCD4表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。TRIzol法提取各組細胞總RNA，進行濃度、純度檢測后，按照SuperScript VILO cDNA合成試劑盒說明書，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以實時熒光定量核酸擴增檢測(RT-qPCR)對PDCD4基因mRNA水平及內(nèi)參基因β-actin水平進行檢測。PDCD4采用NCBI的在線引物設(shè)計工具Primer-BLAST設(shè)計PCR引物，PDCD4上游序列5′-TGAGCACGGAGATACGAACG-3′，下游序列5′-AGGCTAAGGACACTGCCAAC-3′。PCR擴增采用Fast SYBR Green Master Mix試劑盒提供的擴增條件，RT-qPCR擴增后的原始CT值采用2-ΔΔCt方法計算后，進行相對定量分析基因表達水平。

使用天根miRcute miRNA提取分離試劑盒提取各組細胞miRNA后，使用miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒，對所得miRNA同步進行加A尾反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。對逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物采用miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green)進行RT-qPCR，miR-21-5p上游序列5′-GCCTAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3′，下游序列為試劑盒自帶。RT-qPCR擴增后的原始CT值采用2-ΔΔCt方法計算后進行相對定量分析基因表達水平。

1.6 心肌細胞凋亡檢測 采用流式細胞術(shù)。胰酶消化細胞，制成單細胞懸液，按凋亡試劑盒說明書，將100 μL細胞懸液加入5 mL的流式管中，加入Annexinv-APC和PI各5 μL，同時設(shè)定對照：對照1為單純的活細胞，不加任何染料；對照2為活細胞只加Annexinv-APC；對照3為活細胞只加PI，輕輕混勻，室溫、避光孵育15 min，加入400 μL連接緩沖液，1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測，分析結(jié)果。細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/所有細胞數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 各組miR-21表達比較 與正常對照組比較，miR-21 mimic組miR-21表達上升(P<0.01)，miR-21 inhibitor組miR-21表達下降(P<0.05)；與ADR+miR-21 mimic組相比，ADR+四逆湯+miR-21 mimic組miR-21表達上升(P<0.05)；與ADR+miR-21 inhibitor組相比，ADR+四逆湯+miR-21 inhibitor組miR-21表達上升(P<0.05)。見表1。

2.2 各組PDCD4表達比較 與正常對照組比較，miR-21 mimic組PDCD4表達下降(P<0.01)，miR-21 inhibitor組PDCD4表達下降(P<0.05)；與ADR+miR-21 mimic組相比，ADR+四逆湯+miR-21 mimic組PDCD4表達下降(P<0.05)；與ADR+miR-21 inhibitor組相比，ADR+四逆湯+miR-21 inhibitor組PDCD4表達下降(P<0.05)。見表1。

2.3 各組細胞凋亡率比較 與正常對照組比較，ADR+miR-21 mimic組、ADR+miR-21 inhibitor組、ADR+四逆湯組+miR-21 mimic、ADR+四逆湯+miR-21 inhibitor組細胞凋亡率均上升(P<0.05或0.01)；與ADR+miR-21 mimic組相比，ADR+四逆湯+miR-21 mimic組細胞凋亡率下降(P<0.05)；與ADR+miR-21 inhibitor組相比，ADR+四逆湯+miR-21 inhibitor組細胞凋亡率下降(P<0.05)。見表1。

表1 各組細胞miR-21、PDCD4表達及細胞凋亡率比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與ADR+miR-21 mimic組比較，﹟P<0.05；與ADR+miR-21 inhibitor組比較，△P<0.05。

3 討論

自2006年首次發(fā)現(xiàn)miRNA在心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用以來，目前已有大量文獻報道m(xù)iR-21與心臟或心肌多種生理、病理過程的變化有關(guān)[4,5]，miR-21參與了心肌肥大增殖、氧化應(yīng)激、缺血預(yù)適應(yīng)、缺血再灌注損傷、心肌梗死的早期反應(yīng)和心肌組織纖維重構(gòu)等過程的調(diào)控。深入研究包括miR-21在內(nèi)的多種對心血管系統(tǒng)的調(diào)控影響和作用機制，有助于從新的視角認識心血管系統(tǒng)的生理、病理變化過程，使其具有成為心血管疾病治療靶點的可能。目前，中藥與miRNA相關(guān)性的研究正受到普遍關(guān)注，調(diào)節(jié)細胞miRNA的表達很可能是某些天然藥物產(chǎn)生療效的分子機制之一[6,7]。

miR-21在抗心肌細胞凋亡作用的研究日漸受到重視，其參與了多種心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展。實驗研究證實，miR-21具有抗損傷、抗凋亡及死亡的保護效應(yīng)。PDCD4作為miR-21的靶基因，在腫瘤細胞凋亡的調(diào)控中起著重要作用。近年來，miR-21及其靶基因PDCD4在心肌梗死及心肌細胞凋亡方面的調(diào)控作用受到關(guān)注，眾多研究都證實了其對心臟的保護作用。最近研究表明，miR-21可以減輕急性心肌梗死后心肌功能的損害，同時減少心肌細胞的凋亡，上調(diào)miR-21，從而抑制PDCD4的表達，可以明顯地抑制氧化應(yīng)激及缺血再灌注引起的心肌細胞凋亡[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，ADR損傷后，H9C2細胞miR-21表達下降，PDCD4表達則增加。

中醫(yī)認為，心血管疾病具有共同的中醫(yī)病理基礎(chǔ)，本虛是心血管疾的必要條件，多指臟器元氣匱乏，導致功能運轉(zhuǎn)失常。四逆湯為溫里劑，具有回陽救逆之功效，主治心肌梗死、心力衰竭。現(xiàn)代藥理研究表明，四逆湯對損傷的心肌細胞有保護作用[9,10]，但其作用機制尚不明確。本實驗試圖從調(diào)節(jié)miR-21水平及其對靶基因PDCD4的調(diào)節(jié)方面，尋求中醫(yī)名方四逆湯對心肌細胞保護作用的機制及靶點。本研究結(jié)果顯示，與ADR+miR-21 mimic組相比，ADR+四逆湯+miR-21 mimic組miR-21表達上升、PDCD4下降、凋亡細胞百分率降低；而與ADR+miR-21 inhibitor組相比，ADR+四逆湯+miR-21 inhibitor組細胞miR-21表達上升、PDCD4下降、凋亡百分率降低。表明10%四逆湯含藥血清作用72 h后能上調(diào)miR-21的表達、降低PDCD4的表達，抑制心肌細胞凋亡，從而抑制阿霉素導致的心肌細胞損傷，在細胞水平上進一步證實了四逆湯通過調(diào)節(jié)miR-21的表達，靶向抑制PDCD4，進而減少心肌細胞損傷。

綜上所述，四逆湯能保護心肌細胞損傷，其機制可能是通過調(diào)節(jié)miR-21的表達，靶向調(diào)控PDCD4，從而減少心肌細胞凋亡來實現(xiàn)的。這一研究結(jié)果提示miR-21可作為防治心肌損傷的潛在靶點，具有潛在應(yīng)用前景，同時也能為更深入研究四逆湯的分子作用機制提供實驗基礎(chǔ)。