Wnt/β-catenin信號通路在Sfrp1抑制乳鼠心肌纖維化中的作用及機制

陶靜，魏嫻，馬依彤

(1新疆維吾爾自治區人民醫院，烏魯木齊830001；2新疆醫科大學第一附屬醫院)

心肌纖維化可導致心肌僵硬度增加、順應性降低、心臟的收縮舒張功能受限，是獨立的心血管疾病危險因素[1]。研究新的生物干預靶點以延緩或逆轉疾病狀態下的心肌重塑，可能為治療心血管疾病提供新的切入點。Wnt/β-catenin信號通路涉及了機體的生長、發育以及細胞的增殖、凋亡等重要過程。近年研究發現，Wnt/β-catenin信號通路在心肌梗死后可被重新激活，參與調節心室重塑、心肌細胞凋亡、心肌纖維化等病理生理過程[2,3]。可溶性卷曲相關蛋白1(Sfrp1)對Wnt/β-catenin信號通路起負調控作用[4]。前期研究發現，Sfrp1過表達可高效抑制老齡小鼠Wnt/β-catenin通路活性，有效延緩老齡慢性心室重塑進程，進而降低老齡小鼠慢性心力衰竭的發生率和死亡率[5]，然而抑制Wnt/β-catenin信號通路的活性能否有效延緩心肌纖維化尚不明確。2017年1月～2019年1月，本研究利用心肌成纖維細胞增殖模型，進一步明確Sfrp1過表達抑制Wnt/β-catenin信號通路活性抑制心肌纖維化的分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 日齡1～3 d的SD新生乳鼠8只，由新疆醫科大學實驗動物中心提供。DMEM培養基(高糖，Gibco，美國)，胎牛血清(Gibco，美國)，胰蛋白酶(Sigma，美國)，轉化生長因子-β1(TGF-β1，Sigma，美國)，Ⅱ型膠原酶(Worthington，美國)，抗兔β連環蛋白(β-catenin)、α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、GADPH多克隆抗體(CST，美國)，抗兔蓬亂蛋白1(Dvl-1)多克隆抗體(Abcam，美國)，Ⅰ型、Ⅲ型膠原ELIASA試劑盒(USCN，美國)，Caspase-3、Caspase-7活性檢測試劑盒(Promega，美國)，MTT粉、DMSO(Sigma，美國)。dsAAV9-CMV-Sfrp1病毒構建包裝純化來自美國Virovek公司。恒溫離心機(Thermo，美國)，CO2培養箱(Thermo，美國)，垂直流超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司，中國)，倒置熒光顯微鏡(LEICA，德國)。

1.2 乳鼠心肌成纖維細胞原代培養 采用胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶依次消化法獲取乳鼠心肌成纖維細胞，并用差速貼壁法進行純化。分離培養具體方法如前期試驗所述[6]。

1.3 細胞分組及干預方法 將細胞在恒定溫度37 ℃、5%CO2、95%空氣條件下的培養箱中培養，分為對照組、增殖模型組(TGF-β1組)、Sfrp1預處理組(TGF-β1+Sfrp1組)、激活劑實驗組(TGF-β1+Sfrp1+Licl組)。對照組不加任何處理。TGF-β1組：心肌成纖維細胞換無血清DMEM培養液，加入TGF-β110 ng/mL刺激12 h，建立增殖模型。TGF-β1+Sfrp1組前期實驗已經證實最佳轉染復數為1×107(v.g/細胞)，并于轉染后5 d，目的基因表達達高峰[7,8]，dsAAV9-Sfrp1病毒轉染心肌成纖維細胞第5天，建立增殖模型，增殖模型建立方法同TGF-β1組。TGF-β1+Sfrp1+Licl組先將dsAAV9-Sfrp1轉染心肌成纖維細胞，待孵育第4天+12 h時，將Wnt/β-catenin信號通路特異性激活劑Licl加入培養基，終濃度為20 mmol/L，同時建立增殖模型，方法同前。

1.4 Wnt/β-catenin信號通路蛋白β-catenin、Dvl-1表達檢測 采用Western blotting法。收集各組細胞，經裂解提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，加樣總蛋白量40 μg，以上樣緩沖液等體積稀釋，4 ℃冰浴下SDS-PAGE電泳，4 ℃濕轉到PVDF膜上，常規0.05%TBST洗膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，孵育相應一抗、二抗，然后加入顯色液，放入化學發光儀曝光。用Imagelab圖像分析軟件對Western blotting圖片進行分析，以GADPH蛋白含量作為參照。

1.5 肌成纖維細胞分化標志蛋白α-SMA表達檢測 采用Western blotting法。方法同上。

1.6 細胞增殖檢測 采用MTT法。各組細胞加入MTT，確保其終濃度為5 mg/mL，37 ℃避光孵育4 h，加入150 μL DMSO，加入25 μL甘氨酸緩沖液。立即在490 nm處記錄吸光度(OD)值。讀板儀用空白組作為參照。

1.7 細胞周期檢測 采用流式細胞術。收集各組細胞，加入預冷的70%～80%的乙醇，渦旋以混勻細胞，4 ℃避光過夜；分別用PBS、染色液清洗細胞去除所有的乙醇。加入500 μL PI綜合染液，室溫染色30 min后，上流式儀檢測。

1.8 細胞上清液Ⅰ、Ⅲ型膠原含量檢測 采用ELISA法。收集各組心肌成纖維細胞上清液，根據Ⅰ、Ⅲ型膠原ELISA試劑盒說明書按步驟進行操作。

2 結果

2.1 各組β-catenin、Dvl-1蛋白表達比較 與對照組相比，TGF-β1組β-catenin、Dvl-1蛋白表達均上調(P均<0.05)；與TGF-β1組相比，TGF-β1+Sfrp1組β-catenin、Dvl-1蛋白表達均下調(P均<0.05)；與TGF-β1+Sfrp1組相比，TGF-β1+Sfrp1+Licl組β-catenin、Dvl-1蛋白表達均上調(P均<0.05)。見圖1、表1。

注：A為對照組;B為TGF-β1組;C為TGF-β1+Sfrp1組;D為TGF-β1+Sfrp1+Licl組。

圖1各組β-catenin、Dvl-1蛋白表達情況(Western blotting法)

2.2 各組α-SMA蛋白表達比較 與對照組相比，TGF-β1組α-SMA蛋白表達升高(P<0.05)；與TGF-β1組相比，TGF-β1+Sfrp1組α-SMA蛋白表達下調(P<0.05)；與TGF-β1+Sfrp1組相比，TGF-β1+Sfrp1+Licl組α-SMA蛋白表達升高(P<0.05)。見圖2、表1。

注：A為對照組;B為TGF-β1組;C為TGF-β1+Sfrp1組;D為TGF-β1+Sfrp1+Licl組。

圖2 各組α-SMA蛋白表達情況(Western blotting法)

2.3 各組細胞增殖情況比較 與對照組相比，TGF-β1組OD值升高(P<0.05)；與TGF-β1組相比，TGF-β1+Sfrp1組OD值降低(P<0.05)；與TGF-β1+Sfrp1組相比，TGF-β1+Sfrp1+Licl組OD值升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組β-catenin、Dvl-1、α-SMA蛋白表達

注：與對照組比較，*P<0.05；與TGF-β1組比較，﹟P<0.05；與TGF-β1+Sfrp1組比較，△P<0.05。

2.4 各組細胞周期比較 TGF-β1組G0/G1期、G2/M期細胞百分比均低于對照組，S期細胞百分比高于對照組(P均<0.05)；TGF-β1+Sfrp1組G0/G1期、G2/M期細胞百分比均高于TGF-β1組，S期細胞百分比低于TGF-β1組(P均<0.05)；TGF-β1+Sfrp1+Licl組G0/G1期、G2/M期細胞百分比均低于TGF-β1+Sfrp1組，S期細胞百分比均高于TGF-β1+Sfrp1組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組細胞周期比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與TGF-β1組比較，#P<0.05；與TGF-β1+Sfrp1組比較，△P<0.05。

2.5 各組細胞上清液Ⅰ、Ⅲ型膠原含量比較 與對照組相比，TGF-β1組中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量均升高(P均<0.05)；與TGF-β1組相比，TGF-β1+Sfrp1組中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量均降低(P均<0.05)；與TGF-β1+Sfrp1組相比，TGF-β1+Sfrp1+Licl組Ⅰ、Ⅲ型膠原含量均上升(P均<0.05)。見表3。

表3 各組細胞上清液Ⅰ、Ⅲ型膠原含量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與TGF-β1組比較，#P<0.05；與TGF-β1+Sfrp1組比較，△P<0.05。

3 討論

心肌纖維化是心臟對各種刺激產生的適應性增生，是心肌重構的主要表現形式。心肌纖維化表現為心肌成纖維細胞增殖、膠原沉積、肌成纖維細胞表型轉化等，均可增加心肌僵硬度，降低其順應性，限制心臟的收縮功能和舒張功能，是多種心血管疾病共同的病理變化[9]。因此，尋找有效抑制心肌成纖維細胞的增殖、膠原分泌及肌成纖維細胞轉化過程的藥物，將可能有效延緩或阻滯心肌纖維化的發生發展。

目前在體外，關于Sfrp1對心肌梗死組織愈合過程的調控研究結果不一。Barandon等[10]研究表明，過表達Sfrp1的轉基因小鼠可誘導GSK-3β的激活，逆轉心肌梗死后缺血預處理的有益效應；另一方面，過表達Sfrp1的轉基因小鼠可明顯降低心肌梗死的面積，防止心臟破裂，改善心肌功能[11]。Salazar等[12]研究表明，在間充質干細胞條件培養基內，應用Sfrp1可顯著性抑制肺成纖維細胞的增殖。本研究發現，與對照組相比，TGF-β1組β-catenin、Dvl-1蛋白表達均上調，提示TGF-β1刺激后，心肌成纖維細胞中Wnt/β-catenin信號通路成員β-catenin、Dvl-1表達明顯升高，表明Wnt/β-catenin信號通路被激活，參與了心肌成纖維細胞過度增殖過程中。本研究發現，與TGF-β1組相比，TGF-β1+Sfrp1組β-catenin、Dvl-1蛋白表達均下調，提示Sfrp1過表達后β-catenin、Dvl-1表達下調；而與TGF-β1+Sfrp1組相比，TGF-β1+Sfrp1+Licl組β-catenin、Dvl-1蛋白表達均上調，提示當Licl重新激活Wnt/β-catenin信號通路后，β-catenin、Dvl-1表達再次上調，以上結果表明Sfrp1可有效地靶向抑制Wnt/β-catenin信號通路的活性。

最近的研究表明，Wnt/β-catenin信號通路成員在成纖維細胞內的過度表達可調節細胞的增殖、遷移和分化等功能。Hahn等[13]研究發現，β-catenin過表達可刺激新生大鼠心肌成纖維細胞的增殖、分化，誘導心肌細胞發生肥大反應。另外，還有研究表明，Wnt/β-catenin信號通路可能參與了內皮細胞及血管平滑肌細胞的增殖[14,15]。α-SMA的表達增強是肌成纖維細胞分化的標志。本研究發現，在TGF-β1刺激后，Wnt/β-catenin信號通路激活的同時心肌成纖維細胞過度增殖，膠原合成增多，成纖維細胞轉化成肌成纖維細胞。而Sfrp1過表達可有效減輕心肌成纖維細胞的增殖，DNA合成降低，明顯減少心肌成纖維細胞的S期百分率，升高G0/G1及G2/M期的百分率；在膠原合成方面，能抑制成纖維細胞膠原合成，使肌細胞外間質主要成分是Ⅰ、Ⅲ型膠原表達減弱；另外，Sfrp1還明顯地降低了肌成纖維細胞標志性蛋白α-SMA表達，抑制成纖維細胞轉化成肌成纖維細胞。當Licl同時作用，重新激活Wnt/β-catenin信號通路后，心肌成纖維細胞增殖，膠原合成能力，α-SMA表達均再次增強。表明Sfrp1過表達可能通過阻斷Wnt/β-catenin信號通路活性，抑制心肌成纖維細胞的增殖、膠原合成及肌成纖維細胞的分化，從而緩解心肌纖維化的進展。

綜上所述，Sfrp1可抑制心肌成纖維細胞Wnt/β-catenin信號通路活性，顯著抑制心肌成纖維細胞的增殖、膠原合成和肌成纖維細胞的分化，有效緩解病理性心肌纖維化的進展。